中藥預(yù)防流感作用與黏膜免疫相關(guān)性研究①

徐培平 丁 偉 趙 昉 向 燕 李向陽(yáng) 張奉學(xué) (廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州510405)

中醫(yī)藥在預(yù)防流感方面有著豐富的經(jīng)驗(yàn)[1]，前期研究表明，中藥預(yù)防流感的三類主要方藥(辛涼解表劑-銀翹散制劑，扶正祛邪劑-玉屏風(fēng)散制劑，芳香辟穢劑-冰香散制劑)具有較好的作用(另文發(fā)表)。流感是一種呼吸道傳染病，病毒首先侵襲呼吸道黏膜，黏膜表面的免疫反應(yīng)是第一道防線，其分泌性IgA可以有選擇的轉(zhuǎn)移到黏膜表面，能夠結(jié)合病毒防止其粘附和進(jìn)入，在阻止流感病毒感染和傳播中占有重要的地位[2，3]。中藥預(yù)防流感的給藥方式主要是通過(guò)藥物口服、煙熏及佩戴等[4]，我們提出“中藥預(yù)防流感的作用與黏膜免疫相關(guān)性”的設(shè)想[5]，推測(cè)中藥除直接作用于呼吸道黏膜外，還可通過(guò)作用于腸道黏膜，通過(guò)共同黏膜免疫系統(tǒng)進(jìn)而影響呼吸道黏膜IgA分泌，最終在臨床上表現(xiàn)為對(duì)流感的防治。為此，我們進(jìn)行了中藥預(yù)防給藥正常小鼠及流感病毒感染小鼠呼吸道、腸道黏膜分泌IgA的比較研究，以期了解中藥預(yù)防流感的作用與黏膜免疫相關(guān)性，探討中藥預(yù)防流感的黏膜免疫機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c小鼠，雌性，13～15克，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，SPF級(jí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):0098186。

1.1.2 試劑與器材 Mouse IgA ELISA Kit:Bethyl Laboratories，Inc.Lot No:E99-103-111117，120124，110517。乙醚，廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào):20100601-1。利巴韋林，由肇慶星湖藥廠提供，批號(hào):20100821。402AI醫(yī)用超聲霧化器，江蘇魚(yú)躍醫(yī)療設(shè)備有限公司，批號(hào):0805001。YX280A手提式不繡鋼蒸汽消毒器，上海三申醫(yī)療器械有限公司，批號(hào):0602142。FA1004型電子分析天平，上海良平儀器儀表有限公司。YJ-875醫(yī)用凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備廠。超純水器，Millipore。超低溫水箱，Sanyo日本。酶標(biāo)儀(Bio-Teck，ELx800)。

1.1.3 病毒 流感病毒A/FM/1/47(H1N1)鼠肺適應(yīng)株，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所提供，廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所病毒室冷凍保存，于狗腎細(xì)胞(MDCK)傳代，以細(xì)胞病變及雞紅血球血凝法來(lái)判斷其滴度。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)藥物 各配伍組合藥物選定符合2000年版中國(guó)藥典規(guī)定的飲片，購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房。

1.1.4.1 銀翹散制劑 系由銀翹散進(jìn)行加減配伍，主要由銀花、連翹、牛蒡子、貫仲、藿香、荊芥等藥物構(gòu)成。

1.1.4.2 玉屏風(fēng)散制劑 系由玉屏風(fēng)散進(jìn)行加減配伍，主要由防風(fēng)、黃芪、白術(shù)、人參、黃精、北五味等藥物構(gòu)成。

1.1.4.3 冰香散 主要由冰片、廣藿香、艾草等藥物構(gòu)成。

上述方藥按劑量比例配制，根據(jù)《中藥藥理研究方法學(xué)》[6]，按體表面積換算動(dòng)物給藥劑量。銀翹散制劑與玉屏風(fēng)散制劑系將配好的方藥放于砂鍋內(nèi)，加入5倍的冷水浸泡30分鐘，用火加熱，開(kāi)始用強(qiáng)火，沸后改用文火，煮沸1小時(shí)(銀翹散制劑)或1.5小時(shí)(玉屏風(fēng)散制劑)，用紗布過(guò)濾。藥渣加2倍量水繼續(xù)按上法煎煮，沸后煎煮30分鐘，過(guò)濾，合并得2次濾液，于恒重蒸發(fā)皿中，水浴蒸干濃縮成的終濃度為2 g/ml(銀翹散制劑)或3 g/ml(玉屏風(fēng)散制劑)。經(jīng)高壓滅菌20分鐘，冷卻后置冰箱中備用。冰香散采取水煮蒸餾工藝制得精油制劑，終濃度為1.15%。相同的方藥在各實(shí)驗(yàn)組中保持一致。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同預(yù)防方藥預(yù)防給藥對(duì)正常小鼠黏膜免疫的影響 將BALB/c小鼠隨機(jī)分6組，設(shè)空白對(duì)照組(生理鹽水)、利巴韋林組、銀翹散制劑組、玉屏風(fēng)散制劑組、冰香散滴鼻組、冰香散霧化組。不同預(yù)防方藥相應(yīng)采用滴鼻、霧化吸入、口服三種預(yù)防途徑給藥。共給藥12天，每天一次給藥。銀翹散制劑口服給藥，給藥劑量為40 g/kg(生藥材)。玉屏風(fēng)散制劑口服給藥，給藥劑量為60 g/kg(生藥材)。冰香散采用滴鼻與霧化吸入兩種給藥方式，使用時(shí)將冰香散精油混懸于20 ml蒸餾水中(含0.5%吐溫)，微孔濾膜過(guò)濾。冰香散小鼠滴鼻給藥劑量為0.03 g/kg(生藥材)，每次4～5滴，每日2次。冰香散霧化給藥劑量為0.6 g/kg(生藥材)，最大霧化率:4 ml/min。利巴韋林口服給藥，給藥劑量為100 mg/kg。小鼠口服給藥體積為20 ml/kg。給藥第12天，殺剖小鼠，空白對(duì)照組稱體重和肺重測(cè)定肺指數(shù)。各組均采血分離血清，收集鼻咽沖洗液、支氣管肺泡灌洗液、腸道沖洗液進(jìn)行ELISA法檢測(cè)IgA含量。

1.2.2 不同預(yù)防方藥預(yù)防給藥對(duì)流感病毒感染小鼠黏膜免疫的影響 將BALB/c小鼠隨機(jī)分6組，設(shè)病毒對(duì)照組、利巴韋林組、銀翹散制劑、玉屏風(fēng)散制劑、冰香散滴鼻組、冰香散霧化組。在乙醚輕度麻醉下，滴鼻感染15 LD50流感病毒液，每鼠4滴，約0.05 ml。試驗(yàn)藥物在感染攻擊前提前給藥一周，攻擊后繼續(xù)給藥5天，采用滴鼻、霧化吸入、口服三種預(yù)防途徑給藥。共給藥12天，每天一次給藥。給藥劑量及方法見(jiàn)1.2.1。感染后5天，殺剖小鼠，稱體重和肺重測(cè)定肺指數(shù)。采血分離血清，收集鼻咽沖洗液、支氣管肺泡灌洗液、腸道沖洗液進(jìn)行ELISA法檢測(cè)IgA含量。

1.2.3 鼻咽沖洗液的采集 處死小鼠，開(kāi)胸暴露氣管，從氣管中部剪斷，用0.3 ml PBS從氣管斷端向上反復(fù)沖洗鼻咽部，收集從鼻咽部流出的沖洗液，重復(fù)3次。所有沖洗液2 000 r/min×10分鐘離心，收集上清，置-40℃冰箱保存待測(cè)。

1.2.4 支氣管肺泡灌洗液的采集 暴露小鼠的氣管，從氣管中部剪斷，將肺和心臟完整取出，置一平皿內(nèi)，用濾紙沾于肺表面，1 ml PBS從氣管斷端沖洗肺，反復(fù)沖洗3次。將全部灌洗液收集在試管中，4℃，3 000 r/min×10分鐘離心，取上清液分裝，-40℃冰箱保存待測(cè)。

1.2.5 腸道沖洗液的采集 開(kāi)腹暴露小鼠腹腔，游離小腸、取出賁門端至回盲部末端全小腸，平鋪于一平皿中，縱行剖開(kāi)，3 ml PBS反復(fù)沖洗腸腔表面，用載玻片輕刮黏膜表面粘液置EP管內(nèi)，2 000 r/min 15分鐘離心，收集上清、-40℃保存待測(cè)。

1.2.6 小鼠血清的收集 摘眼球采血，收集血液后，3 000 r/min離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離，收集血清，-40℃保存待測(cè)。

1.2.7 IgA的測(cè)定 按小鼠IgA的ELISA試劑盒要求測(cè)定:取稀釋后的樣品20 μl，加入96孔板，隨后加入80 μl樣品緩沖液，20℃恒溫振蕩60分鐘;洗板后加入100 μl以HRP標(biāo)記的抗小鼠IgA抗體，混勻，20℃ ×30分鐘;洗板后加入TMB底物溶液，混勻，20℃ ×15分鐘;加入100 μl終止液，混勻，可見(jiàn)樣品顏色由藍(lán)轉(zhuǎn)黃。于450 nm波長(zhǎng)處以酶標(biāo)儀測(cè)定試樣OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線換算IgA濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)間的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所測(cè)數(shù)據(jù)以±s表示。IgA、肺指數(shù)采用單因素方差分析(ANOVA)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 中藥預(yù)防給藥對(duì)H1N1甲型流感病毒感染小鼠的抑制作用 見(jiàn)表1，流感病毒滴鼻感染小鼠可導(dǎo)致病毒性肺炎，肺部表現(xiàn)為炎癥、出血等肺炎病變。肺組織由此增重，體重下降。病毒對(duì)照組與正常小鼠肺重相比明顯增加，肺指數(shù)上升，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。銀翹散制劑、玉屏風(fēng)散制劑、冰香散均有不同程度的抑制作用，肺指數(shù)抑制率達(dá)到25.46%～41.61%。其中銀翹散制劑、玉屏風(fēng)散制劑、冰香散霧化給藥與病毒對(duì)照組相比，差別有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與病毒對(duì)照組相比，冰香散滴鼻給藥雖然在肺重與肺指數(shù)上有一定程度的下降，但差別沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義(P＞0.05)。

表1 中藥預(yù)防給藥對(duì)H1N1甲型流感病毒感染小鼠的抑制作用(±s)Tab．1 The inhibitory effect of preventive herbs on mice infected with influenza A virus(±s)

表1 中藥預(yù)防給藥對(duì)H1N1甲型流感病毒感染小鼠的抑制作用(±s)Tab．1 The inhibitory effect of preventive herbs on mice infected with influenza A virus(±s)

Note:Compared with virus control group，1)P ＜0.05，2)P ＜0.01;3)Lung index=(lung weight of mice/body weight of mice) ×100;4)Inhibition rate of lung index=(mean of lung index of Virus control group-mean of lung index of trial drug groups)/mean of lung index of Virus control group×100.

Groups Dosage(g/kg)Number(n)Lung weight(mg)Lung index3)(g/g)Inhibition rate of lung index4)(%)Blank control - 10 0.146±0.0182) 0.71±0.052)-Virus control - 10 0.226±0.041 1.61±0.36 -Ribavirin 0.1 10 0.177±0.038 1.08±0.391) 32.91 Yinqiao Powder Preparation 40 11 0.191±0.044 1.04±0.421) 35.40 Jade Screen Powder Preparation 60 11 0.177±0.039 0.94±0.412) 41.61 Bing-xiang Powder Preparation/Nasal drops 0.03 9 0.197±0.025 1.20±0.33 25.46 Bing-xiang Powder Preparation/Nebulised inhalation 0.6 9 0.175±0.049 1.09±0.431)32.29

表2 不同預(yù)防方藥對(duì)正常小鼠黏膜免疫的影響(±s)Tab．2 Effect of several different preventive herbs on mucosal immunity of normal mice(±s)

表2 不同預(yù)防方藥對(duì)正常小鼠黏膜免疫的影響(±s)Tab．2 Effect of several different preventive herbs on mucosal immunity of normal mice(±s)

Note:Compared with Blank control group，1)P＜0.05，2)P ＜0.01;3)P=0.065.

Groups Dosage(g/kg)Number(n)Serum IgA(mg/ml)Nasopharynx sIgA(μg/ml)Bronchiole-alveolar sIgA(μg/ml)Intestimal sIgA(mg/ml)2.46 24.9±20.8 Ribavirin 0.1 10 2.29±1.14 0.52±0.23 7.43±1.671) 25.1±20.4 Yinqiao Powder Preparation 40 10 5.54±1.512) 0.90±0.81 13.69±2.77 38.6±28.5 Jade Screen Powder Preparation 60 11 2.68±2.39 0.73±0.50 10.77±2.98 51.4±32.61)Bing-xiang Powder Preparation/Nasal drops 0.03 11 1.59±0.55 1.50±1.171) 15.58±2.333) 48.2±27.9 Blank control - 10 1.80±0.32 0.85±0.45 13.09±Bing-xiang Powder Preparation/Nebulised inhalation 0.6 10 4.17±2.482)0.94±0.51 11.95±3.77 38.9±30.2

2.2 中藥預(yù)防給藥對(duì)正常小鼠黏膜免疫的影響見(jiàn)表2，正常小鼠連續(xù)給予不同預(yù)防方藥12天，銀翹散制劑口服與冰香散霧化給藥血清IgA水平顯著提高，較之空白對(duì)照差異明顯(P＜0.01)。玉屏風(fēng)散、利巴韋林、冰香散滴鼻給藥血清IgA水平與空白對(duì)照組差別不明顯(P＞0.05)。說(shuō)明銀翹散和冰香散霧化給藥有提升機(jī)體免疫力的作用。

冰香散滴鼻給藥能提升鼻咽部sIgA水平，較之空白對(duì)照組差異明顯(P＜0.05)。其余各組藥物鼻咽部sIgA水平與空白對(duì)照組差別不明顯(P＞0.05)。

利巴韋林組給藥，支氣管-肺泡sIgA水平下降，較之空白對(duì)照組差異明顯(P＜0.05)，說(shuō)明利巴韋林100 mg/kg劑量長(zhǎng)期給藥對(duì)機(jī)體免疫有一定的抑制作用。冰香散滴鼻給藥，支氣管-肺泡sIgA水平有一定的提升，較之空白對(duì)照組有一定的差異，但未達(dá)到P＜0.05的水平(P=0.065)，說(shuō)明冰香散滴鼻對(duì)呼吸道sIgA水平有一定的提升作用。

銀翹散制劑、玉屏風(fēng)散制劑、冰香散長(zhǎng)期給藥對(duì)于腸道sIgA水平有一定的提升作用，其中玉屏風(fēng)散制劑作用明顯，較之空白對(duì)照組差異明顯(P＜0.05)。

2.3 中藥預(yù)防給藥對(duì)流感病毒感染小鼠黏膜免疫的影響 不同預(yù)防方藥給藥7天，繼之感染流感病毒，繼續(xù)同時(shí)給藥5天，病毒感染小鼠黏膜免疫情況見(jiàn)表3。

表3 不同預(yù)防方藥對(duì)流感病毒感染小鼠黏膜免疫的影響(±s)Tab．3 Effect of several different preventive herbs on mucosal immunity of mice infected with influenza virus(±s)

表3 不同預(yù)防方藥對(duì)流感病毒感染小鼠黏膜免疫的影響(±s)Tab．3 Effect of several different preventive herbs on mucosal immunity of mice infected with influenza virus(±s)

Note:Compared with virus control group，1)P ＜0.05，2)P ＜0.01.

Groups Dosage(g/kg)Number(n)Serum IgA(mg/ml)Nasopharynx sIgA(μg/ml)Bronchiole-alveolar sIgA(μg/ml)Intestimal sIgA(mg/ml).68 90.2±46.8 Ribavirin 0.1 10 1.12±0.352) 0.29±0.16 4.40±1.181) 72.4±23.9 Yinqiao Powder Preparation 40 10 1.92±0.34 0.35±0.26 8.99±1.19 89.9±32.0 Jade Screen Powder Preparation 60 10 1.91±0.41 0.34±0.30 10.38±1.202) 130.1±40.91)Bing-xiang Powder Preparation/Nasal drops 0.03 11 1.82±0.32 0.55±0.381) 9.53±2.25 86.0±24.7 Virus control - 10 1.74±0.42 0.33±0.14 8.19±1 Bing-xiang Powder Preparation/Nebulised inhalation 0.6 11 2.45±0.662) 0.29±0.13 9.99±2.471) 199.6±78.22)

血清IgA水平方面:利巴韋林組呈下降作用，冰香散霧化給藥則表現(xiàn)為提升作用，與病毒對(duì)照組相比差異明顯(P＜0.01)。其余各組與病毒對(duì)照組差別不明顯(P＞0.05)。

鼻咽部sIgA水平方面:冰香散滴鼻給藥能提升鼻咽部sIgA水平，較之病毒對(duì)照組差異明顯(P＜0.05)。其余各組藥物鼻咽部sIgA水平與病毒對(duì)照組差別不明顯(P＞0.05)。

支氣管-肺泡sIgA水平方面:利巴韋林組呈降低作用，玉屏風(fēng)散與冰香散霧化給藥表現(xiàn)為提升作用，與病毒對(duì)照組差異明顯(P＜0.05)。銀翹散口服與冰香散滴鼻給藥支氣管-肺泡灌洗液sIgA水平雖有一定程度的提升，但與病毒對(duì)照組相比，差異不明顯(P＞0.05)。

腸道黏液sIgA水平方面:玉屏風(fēng)散制劑與冰香散霧化表現(xiàn)一定的提升作用，與病毒對(duì)照組相比，差異明顯(P＜0.05～0.01)。其余各組差異不明顯(P＞0.05)。

3 討論

黏膜免疫是機(jī)體抗感染的第一道免疫屏障，IgA是黏膜免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)分子[7]。體內(nèi)IgA按其免疫功能大致可分為血清型IgA和分泌型IgA。血清型IgA存在于血清中，其含量占總IgA的85%左右。血清型IgA介導(dǎo)調(diào)理吞噬ADCC作用[8]，有類似IgG和IgM的某些功能。分泌型IgA存在于分泌液中(如唾液、淚液、初乳、鼻和支氣管分泌液、胃腸液、尿液、汗液等)，是機(jī)體黏膜局部抗感染免疫的主要抗體，故又稱黏膜局部抗體[9]。

流感是一種呼吸道傳染病，病毒首先侵襲呼吸道黏膜。病毒感染之初，黏膜上的病毒載量較低，在此阻斷病毒的侵襲是最有效的。sIgA通過(guò)覆蓋在病毒表面，使其不能附著在易感細(xì)胞上，從而阻止它們進(jìn)入或破壞細(xì)胞;不需要補(bǔ)體參與就可起到中和病毒的作用，附著在細(xì)菌的鞭毛上，讓其活動(dòng)性減弱，并且更容易被巨噬細(xì)胞吞噬[10]。呼吸道分泌液中sIgA含量的高低直接影響呼吸道黏膜對(duì)病原體的抵抗力，兩者呈正相關(guān)[11]。

中醫(yī)藥在預(yù)防流感方面有較好的效果[12]。本研究表明，銀翹散制劑、玉屏風(fēng)散制劑口服給藥及冰香散外用對(duì)流感病毒感染鼠有較好的預(yù)防作用，能一定程度上減輕感染鼠肺病變程度。

外來(lái)抗原(包括病毒、細(xì)菌、藥物等)進(jìn)入呼吸道或消化道，局部免疫系統(tǒng)受到刺激后，無(wú)需中央免疫系統(tǒng)的參與，自身就可進(jìn)行免疫應(yīng)答，產(chǎn)生分泌型抗體，即sIgA。中藥預(yù)防的三種給藥方式:口服、煙薰、芳香佩戴等均可作用于呼吸道或消化道黏膜，激發(fā)局部黏膜免疫產(chǎn)生分泌型sIgA，從而起到預(yù)防和治療的效果。

黏膜免疫是區(qū)別于全身免疫的局部免疫，黏膜免疫的基礎(chǔ)是胃腸道、呼吸道等處存在著大量的淋巴樣組織構(gòu)成完整而普遍的黏膜免疫系統(tǒng)[13]。機(jī)體95%以上的感染發(fā)生在黏膜或由黏膜入侵機(jī)體;同時(shí)黏膜既存在局部免疫又存在共同免疫系統(tǒng)，使黏膜免疫細(xì)胞相對(duì)獨(dú)立于系統(tǒng)免疫。中藥口服、經(jīng)腸道、噴鼻給藥均可誘導(dǎo)共同黏膜免疫應(yīng)答，有較好的刺激產(chǎn)生呼吸道黏膜免疫的作用[14]，這是中藥預(yù)防流感的主要機(jī)制之一。

呼吸道和胃腸道黏膜都是機(jī)體黏膜免疫系統(tǒng)的一部分，當(dāng)一處黏膜發(fā)生病變時(shí)，可以通過(guò)黏膜免疫歸巢遷移的途徑影響傳變到另一處。腸道相關(guān)淋巴樣組織(GALT)與支氣管相關(guān)淋巴樣組織(BALT)和其他部位黏膜的淋巴樣組織一起，形成一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的免疫應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)節(jié)人體黏膜的免疫應(yīng)答[15]。呼吸道黏膜與腸黏膜通過(guò)免疫細(xì)胞的定向歸巢遷移建立起了密切的聯(lián)系。胃腸道是產(chǎn)生sIgA的主要器官，腸黏膜B細(xì)胞分泌的免疫球蛋白中70% ～90%是IgA[16]。腸道發(fā)生免疫后，B細(xì)胞產(chǎn)生大量的IgA，并由腸道向呼吸道和其它效應(yīng)部位歸巢遷移，這是口服黏膜免疫疫苗及藥物口服預(yù)防流感的作用原因之一。

本研究表明:玉屏風(fēng)散制劑對(duì)正常小鼠灌胃給藥12天可使腸道IgA分泌增加，能使流感病毒感染鼠腸道sIgA分泌增加，支氣管肺泡IgA分泌增加。冰香散霧化給藥對(duì)正常小鼠血清IgA水平有明顯的提升作用，對(duì)呼吸道及腸道黏膜IgA分泌的影響作用較弱;對(duì)流感病毒感染小鼠，除提升血清IgA水平外，對(duì)下呼吸道黏膜及腸道黏膜的IgA分泌有明顯的促進(jìn)作用。說(shuō)明玉屏風(fēng)散與冰香散霧化能較大提升腸道sIgA水平，同時(shí)上調(diào)呼吸道分泌型免疫球蛋白A分泌。上述藥物能通過(guò)共同黏膜免疫途徑激活腸道黏膜免疫，進(jìn)而提升呼吸道黏膜的IgA水平，達(dá)到預(yù)防流感病毒的作用。有研究表明玉屏風(fēng)總多糖是玉屏風(fēng)散免疫干預(yù)作用的主要有效成分，能通過(guò)腸道過(guò)程使免疫低下模型小鼠腸道和呼吸道IgA的分泌增加，玉屏風(fēng)總多糖通過(guò)作用于腸道黏膜，進(jìn)而影響呼吸道黏膜，乃至整個(gè)黏膜免疫系統(tǒng)，并最終表現(xiàn)為全身免疫功能的改變[17]。這為中醫(yī)臨床玉屏風(fēng)散用于體弱體質(zhì)人群預(yù)防流感提供了黏膜免疫機(jī)制上的依據(jù)[18]。

鼻腔黏膜免疫IgA抗體對(duì)于鼻黏膜及呼吸道病原體感染具有重要意義[19]。鼻部血管分布度高;覆蓋鼻部上皮的大量微絨毛細(xì)胞為抗原吸附提供了豐富的表面積;鼻腔免疫能同時(shí)誘導(dǎo)黏膜和系統(tǒng)免疫應(yīng)答[20]。藥物口服、滴鼻和氣霧給藥可作用于呼吸道與腸道黏膜下層淋巴系統(tǒng)，被攝取、遞呈，激活T細(xì)胞，輔助B細(xì)胞進(jìn)行IgA類型轉(zhuǎn)化[21]。由于共同黏膜免疫系統(tǒng)的存在，當(dāng)特異性B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞激活后從NALT遷移至區(qū)域淋巴結(jié)然后進(jìn)入血液或胸淋巴循環(huán)，這些淋巴細(xì)胞歸巢并作用于遠(yuǎn)程呼吸道黏膜部位，產(chǎn)生sIgA抗體作為預(yù)防這些部位病原體引起的感染。本研究表明，冰香散滴鼻給藥對(duì)正常小鼠呼吸道黏膜IgA分泌有明顯增加，但對(duì)腸道黏膜分泌IgA無(wú)明顯作用。對(duì)流感病毒感染小鼠鼻咽黏膜的IgA分泌有明顯的提升作用，但對(duì)下呼吸道及腸道黏膜IgA分泌作用不明顯。冰香散采用超聲波霧化吸入治療是將藥液置于超聲波霧化器中，利用電藕合產(chǎn)生震蕩，經(jīng)藥液瓶底的薄膜超聲作用于藥液瓶中的水溶性藥物使藥液產(chǎn)生直徑1～5 μm的氣霧出口，鼻吸入氣管、支氣管、肺泡內(nèi)直接作用于呼吸道黏膜而激活黏膜免疫系統(tǒng)[22]。從藥物組成及成分看，冰香散系含有各種芳香性揮發(fā)性精油，可直接作用鼻腔部黏膜，激活產(chǎn)生sIgA，而sIgA抗體形成細(xì)胞主要進(jìn)入血循環(huán)，歸巢至系統(tǒng)淋巴結(jié)或組織炎癥部位，可阻止流感病毒在鼻黏膜處的粘附感染與增殖擴(kuò)散，以切斷病毒傳播途徑，增加局部抵抗力，預(yù)防流感的發(fā)生，這是中醫(yī)藥芳香療法“辟疫”、“防瘟”的可能機(jī)理所在。

利巴韋林(病毒唑)為廣譜的核苷類藥物，對(duì)多種RNA或DNA病毒體內(nèi)外都有抑制作用，在體外對(duì)金剛烷胺敏感株和耐藥株甲型流感病毒均有顯著的抑制作用[23，24]。利巴韋林在抑制病毒 DNA 或RNA合成過(guò)程中，也可能抑制宿主細(xì)胞的DNA或RNA合成，故臨床上利巴韋林的副作用往往隨藥物總量和療程的增加而逐漸增大。本研究發(fā)現(xiàn):正常小鼠口服給予利巴韋林100 mg/kg劑量，12天，支氣管-肺泡分泌的IgA水平下降;對(duì)病毒感染小鼠的血清IgA及支氣管-肺泡分泌的IgA水平也表現(xiàn)出降低作用，說(shuō)明利巴韋林對(duì)黏膜免疫IgA的分泌有一定的抑制作用，這可能與利巴韋林較大劑量(100 mg/kg)及較長(zhǎng)時(shí)間給藥(12天)有關(guān)。亦有研究表明，利巴韋林有明顯的免疫抑制作用:利巴韋林可抑制細(xì)胞免疫反應(yīng)，使小鼠脾臟T細(xì)胞對(duì)ConA的增殖反應(yīng)明顯降低[25];還可使幼鼠胸腺發(fā)育受抑制、胸腺萎縮、重量減輕;對(duì)非特異性免疫功能也有抑制作用。表明利巴韋林用于流感病毒的治療除與其干預(yù)病毒的復(fù)制環(huán)節(jié)外，還有可能與它的免疫抑制作用減輕了病毒感染的炎癥反應(yīng)有關(guān)[26]。從預(yù)防的角度而言，利巴韋林對(duì)黏膜免疫的抑制作用似乎不宜推薦作為流感病毒的預(yù)防性長(zhǎng)期用藥。

銀翹散制劑給予正常小鼠口服給藥12天，血清IgA水平增加，但呼吸道及腸道黏膜IgA分泌未見(jiàn)明顯增加。對(duì)流感病毒感染鼠呼吸道及腸道黏膜IgA分泌亦未見(jiàn)明顯影響，說(shuō)明銀翹散對(duì)流感病毒感染鼠的黏膜免疫作用較弱，其預(yù)防流感的作用可能通過(guò)其他免疫途徑而實(shí)現(xiàn)。

實(shí)際上IgA表達(dá)的每一步都是受細(xì)胞因子控制的。IgA的產(chǎn)生需要T細(xì)胞的幫助，來(lái)自黏膜相關(guān)淋巴組織(MALT)的T細(xì)胞對(duì)IgA的產(chǎn)生起非常重要的作用，但是，僅有T細(xì)胞并不能有效誘導(dǎo)IgA的產(chǎn)生，這一過(guò)程還受Th1/Th2細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)。此外，T細(xì)胞能直接調(diào)節(jié)IgA應(yīng)答。在呼吸道黏膜中還分布有大量的樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)，其活化與否對(duì)黏膜的免疫應(yīng)答也有調(diào)節(jié)作用[27-29]。因此，中藥通過(guò)干預(yù)調(diào)節(jié)黏膜免疫來(lái)預(yù)防流感的具體機(jī)制尚有待于進(jìn)一步的研究。

1 楊曉昀.從中醫(yī)學(xué)試論甲型H1N1流感的防治[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2010;7(6):136-137.

2 Clements M L，Betts R F，Tierney E L et al．Serum and nasal wash antibodies associated with resistance to experimental challenge with influenza A wild-type virus[J].J Clin Microbiol，1986;24:157-161.

3 Reneagar K B，Amall P A.Immunoglobulin A mediation of murine nasal anti-influenza virus immunity [J].J Virol，1991;65:2146-2150.

4 孫翠娥，楊篤然，丁正琪et al．中草藥煙熏對(duì)空氣消毒及預(yù)防呼吸道傳染病作用的研究[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2007;7(12):1884-1885.

5 徐培平，劉 妮，丁 偉 et al．中藥預(yù)防流感的作用及其機(jī)制[J].熱帶病與寄生蟲(chóng)學(xué)，2011;4(9):246-248.

6 陳 奇.中藥藥理研究方法學(xué)[M].第3版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2011:1103-1105.

7 曾常茜.分泌型IgA在黏膜抗感染中的作用[J].北華大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2005;6(1):33-35.

8 Tagliabue A，Nencioni L，Villa L et al．Antibody-dependent cell mediated antibacterial activity of intestinal lymphocytes with secretory IgA [J].Nature，1983;306(5959):184-186.

9 Bomsel M.Transcytosis of infectious human immunodeficiency virus across a tight human epithelial cell line barrier[J].Nat Med，1997;3:42-47.

10 張寶中，冉多良，童貽剛.分泌型免疫球蛋白A的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通訊，2009;20(2):263-265.

11 Mazanec M B，Nedrud J G，Kaetzel C S et al.A three-tiered view of the role of IgA in mucosal defense[J].Immunol Today，1993;14:430-435.

12 蘇惠萍，沈 薔，武維屏et al．中醫(yī)預(yù)防方案干預(yù)社區(qū)流感的隨機(jī)對(duì)照研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010;33(10):690-694.

13 黃孝文.上呼吸道黏膜免疫和免疫病理[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)·耳鼻咽喉科學(xué)分冊(cè)，1999;23(5):274-276.

14 李清艷，史書(shū)軍，翟向和 et al．氣霧免疫在禽病防治中的應(yīng)用[J].獸醫(yī)導(dǎo)刊，2007;21(3):30-32.

15 靳文學(xué)，楊 宇.從黏膜免疫系統(tǒng)看“肺與大腸相表里”[J].四川中醫(yī)，2005;23(12):1-3.

16 MacDonald T.The mucosal immune system [J].Parasite Immunol，2003;25(5):235-238.

17 張 磊，李東曉，吳 瑕et al．玉屏風(fēng)散總多糖影響腸道黏膜損傷小鼠腸-呼吸道分泌研究[J].中藥藥理與臨床，2007;23(5):43-45.

18 閏躍龍，姜惠明.中醫(yī)方劑玉屏風(fēng)散預(yù)防流感[J].中國(guó)社區(qū)醫(yī)師·醫(yī)學(xué)專業(yè)半月刊，2010;12(12):23-24.

19 Ichinohe T，Watanabe I，Ito S et al．Synthetic double-stranded RNA poly(I:C)combined with mucosal vaccine protects against influenza virus infection [J].J Virol，2005;79(5):2910-2919.

20 陳怡婷，曹 炬，李岱容et al．ClpP黏膜免疫預(yù)防小鼠發(fā)生肺炎鏈球菌性肺炎和敗血癥[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志，2009;25(6):556-560.

21 Wu H Y，Nguyen H H，Russell M W.Nasal lymphoid tissue(NALT)as a mucosal immune inductive site[J].Scand J Immunol，1997;46:506-513.

22 郭玉環(huán)，孔 麗，付桂才et al．中藥?kù)F化吸入治療毛細(xì)支氣管炎臨床研究[J].濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001;24(4):49-50.

23 占揚(yáng)清，關(guān)文達(dá)，王玉濤et al．金剛烷胺與利巴韋林對(duì)不同甲型流感病毒株的體外作用敏感性比較[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2010;10(9):1058-1061.

24 高榮梅，李興瓊，何維英et al．利巴韋林注射液體內(nèi)外抗流感病毒作用研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010;45(3):403-407.

25 陳其御，楊建勤.利巴韋林在體外對(duì)小鼠脾細(xì)胞NK活性的影響[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，1995;30(6):417-421.

26 南景一，孫曉蘭，高 梅et al．利巴韋林對(duì)幼鼠免疫功能的影響[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，1997;17(7):299-300.

27 Neurath M F，F(xiàn)inotto S，Glimcher L H.The role of TH1/TH2 polarization in mucosal immunity[J].Nat Med，2002;8:567-573.

28 Oman S，Jansen H M，Out T A et al．Interleukin-4 and interferongamma synergistically increase secretary component gene expression，but are additive in stimulating secretary immunoglobulin A release by calu-3 airway epithelial cells[J].Immunology，1999;96(4):537-543.

29 Heystek H C，Moulon C，Woltrnun A M et al．Human immature dendritic cells efficiently bind and take up secretory IgA without the induction of maturation[J].J Immunol，2002;168(1):102-107.