骨髓瘤細(xì)胞裂解物致敏的DC-CIK細(xì)胞抗骨髓瘤細(xì)胞作用①

羅 云 白鳳霞 張 萍 婁世鋒 (重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院血液科，重慶400010)

多發(fā)性骨髓瘤(Multiple Myeloma，MM)是漿細(xì)胞的惡性腫瘤，好發(fā)于老年人，占血液腫瘤的第二位。隨著多發(fā)性骨髓瘤治療新藥的出現(xiàn)及干細(xì)胞移植技術(shù)的進(jìn)步，多發(fā)性骨髓瘤治療緩解率較前大為提高，生存時間明顯延長[1];但復(fù)發(fā)、難治仍是臨床面臨的巨大難題。尋找新的治療手段或聯(lián)合治療方案仍然具有緊迫性，過繼細(xì)胞免疫治療毒副反應(yīng)輕，適應(yīng)人群廣，通過直接向腫瘤患者輸注具有抗腫瘤活性的免疫活性細(xì)胞，使其在體內(nèi)發(fā)揮抗腫瘤作用。CIK細(xì)胞單獨或與DC細(xì)胞聯(lián)合已廣泛用于實體腫瘤和白血病，但鮮見用于骨髓瘤。我們自2011年7月～2011年12月體外培養(yǎng)負(fù)載骨髓瘤裂解物的健康供者DC聯(lián)合CIK細(xì)胞，觀察其對骨髓瘤U266細(xì)胞株的殺傷作用，以期進(jìn)一步應(yīng)用于臨床。

1 材料與方法

1.1 材料 U266細(xì)胞株購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院細(xì)胞庫，RPMI1640培養(yǎng)基購自 Gibco公司，IFN-γ購自上海凱茂生物公司，IL-2購自北京雙鷺?biāo)帢I(yè)、IL-4、rhGM-CSF廈門特寶生物公司饋贈，淋巴細(xì)胞分離液購自天津灝洋生物制品公司，TNF-α購自Protech公司，蛋白定量試劑盒購自南京凱基生物公司，NP40購自Abbott公司;熒光素FITC標(biāo)記的鼠抗人CD3、CD1a及CD83，藻紅蛋白PE標(biāo)記的鼠抗人CD8和CD56及CD86和CD80單克隆抗體購自BD公司;CO2培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器公司)，倒置顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠)，全自動生化儀(日本日立公司)，離心機(jī)(湖南平凡儀器廠)，流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

1.2 骨髓瘤U266細(xì)胞抗原制備 U266細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每3～4日換液;取足夠的對數(shù)生長期細(xì)胞，在-80℃深低溫冰箱冰凍，然后復(fù)溫至37℃，反復(fù)凍融3次，再于冰浴中超聲波破碎后，離心(1 000 r/min，5分鐘)，收集上清液，用孔徑為0.22 μm濾膜過濾滅菌，通過蛋白定量試劑盒檢測蛋白含量，最后-80℃保存，作為抗原備用。

1.3 CIK細(xì)胞的培養(yǎng)征得異基因干細(xì)胞移植供者知情同意并簽署知情同意書后，用血細(xì)胞分離機(jī)(COBE公司)單個核程序單采健康供者(共5例，具體見表1)。

單個核細(xì)胞懸液100 ml，自體血漿200 ml，然后淋巴細(xì)胞分離液再次分離收集細(xì)胞，分裝，部分細(xì)胞凍存，剩余細(xì)胞培養(yǎng)在含10%自體血漿RPMI1640培養(yǎng)液中，4～6小時后，貼壁細(xì)胞用于DC細(xì)胞培養(yǎng)，取懸浮細(xì)胞離心，重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1 ×106ml-1，加入含 IFN-γ(1 000 U/ml)培養(yǎng)1 日，第2日加入含小鼠抗人CD3單克隆抗體(100 mg/ml)、IL-2(1 000 U/ml)的CIK培養(yǎng)液，置于37℃，5%CO2體積分?jǐn)?shù)為的培養(yǎng)箱中，每隔3天補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)液。

1.4 DC細(xì)胞的培養(yǎng) 取上述貼壁細(xì)胞培養(yǎng)在含10%自體血漿RPMI1640培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液中加入rhGM-CSF(1 000 U/ml)和 IL-4(1 000 U/ml);每3天換液，第7日將培養(yǎng)DC細(xì)胞分為2組，一組加入TNFα 500 U/ml，另一組加入U266細(xì)胞裂解物100 μg/ml，分別與上述培養(yǎng) CIK細(xì)胞再共培養(yǎng)7日(n=5)。

表1 異基因干細(xì)胞供者資料Tab．1 Donor characteristics

1.5 CIK及DC細(xì)胞形態(tài)觀察 在倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)，收集培養(yǎng)細(xì)胞PBS洗滌后涂片，3%戊二醛4℃固定2小時，再以體積分?jǐn)?shù)為1%鋨酸固定，梯度酒精脫水，用六甲基二硅胺烷干燥，噴鍍、導(dǎo)電，KYKY 1000B型掃描電鏡觀察，并攝片。

1.6 CIK及DC細(xì)胞表型測定 收集培養(yǎng)的細(xì)胞1×106ml-1，離心用PBS洗滌2次，每管分別加入藻紅蛋白PE標(biāo)記，熒光素FITC標(biāo)記CD單抗各10 μl，室溫避光孵育30分鐘，再用PBS洗掉未結(jié)合單抗，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測細(xì)胞表面標(biāo)志(n=5)。

1.7 CIK細(xì)胞及DC-CIK細(xì)胞殺傷活性檢測(LDH法) 24孔板中將培養(yǎng)的CIK與DC-CIK細(xì)胞與靶細(xì)胞 U266 按5∶1、10∶1 及20∶1 混合，同時設(shè)定自然釋放孔及單獨加NP40的最大釋放孔，每組設(shè)3個復(fù)孔;37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱孵育4小時后離心取上清液，全自動生化儀測定LDH含量，同時以白血病K562細(xì)胞株作為對照組(n=5)。按如下公式計算殺傷率:殺傷率(%)=(試驗孔-靶細(xì)胞自然釋放孔)/(靶細(xì)胞最大釋放孔-靶細(xì)胞自然釋放孔)×100%。

2 結(jié)果

2.1 CIK及DC細(xì)胞形態(tài) 培養(yǎng)的CIK細(xì)胞大部分為圓形，少數(shù)為梭形(圖1)，DC細(xì)胞培養(yǎng)3～4天后開始出現(xiàn)突起，有聚集成簇現(xiàn)象(圖2)，貼壁5～6日后逐漸開始懸浮生長，掃描電鏡下可見:DC體積較大，胞體突起形成不規(guī)則形態(tài)，表面粗糙，有圓形或橢圓形隆起，層疊狀皺襞(圖2)。

圖1 倒置顯微鏡下培養(yǎng)12日的CIK細(xì)胞(×200)Fig．1 CIK cells were observed by inverted microscope at 12 days(×200)

圖2 倒置顯微鏡(A，×400)及掃描電鏡(B，×1 500)下觀察培養(yǎng)7日的DC細(xì)胞圖片F(xiàn)ig．2 Dendritic cells were observed by inverted microscope(A，×400)and scanning(B，×1 500)

圖3 培養(yǎng)第7日及培養(yǎng)第14日的CIK細(xì)胞CD3、CD56共表達(dá)Fig．3 CIK cells surface co-expressed CD3 and CD56 at 7 days and 14 days

2.2 CIK及DC細(xì)胞表面標(biāo)志 利用流式細(xì)胞儀檢測培養(yǎng)12～14日CIK細(xì)胞高表達(dá)CD3，CD3及CD56共表達(dá)明顯升高(圖3)，未成熟DC細(xì)胞高表達(dá)CD1a，經(jīng)過 TNF-α或瘤細(xì)胞裂解物刺激表達(dá)CD86、CD80明顯升高。

2.3 CIK和負(fù)載瘤細(xì)胞裂解物DC-CIK對U266殺傷作用 U266細(xì)胞自然釋放及培養(yǎng)CIK細(xì)胞和DC-CIK作用U266細(xì)胞后乳酸脫氫酶經(jīng)過全自動生化儀檢測，兩組各自的殺傷活性均隨效靶比升高而增強(qiáng)，各效靶比間的差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。負(fù)載瘤細(xì)胞裂解物DC-CIK與單獨CIK在同效靶比下殺傷性更強(qiáng)，各組間差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。培養(yǎng)的CIK細(xì)胞對K562細(xì)胞殺傷率亦隨效靶比升高而增加，但負(fù)載骨髓瘤細(xì)胞抗原DC細(xì)胞與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)后對K562細(xì)胞殺傷率與單獨CIK細(xì)胞比較無明顯差異(P＞0.05)，見圖4、5。

圖4 CIK及DC+CIK對U266細(xì)胞作用(n=5)Fig．4 CIK cells or DC+CIK cytotoxic effect for myeloma U266 cell(n=5)

圖5 CIK及負(fù)載骨髓瘤抗原的DC+CIK對K562細(xì)胞作用(n=5)Fig．5 CIK cells or DC+CIK cells cytotoxic effect for K562 cell(n=5)

3 討論

多發(fā)性骨髓瘤是高發(fā)于老年人的血液系統(tǒng)常見惡性腫瘤，發(fā)展較為緩慢。臨床治療效果欠佳，完全緩解率(CR)低，自體移植可提高CR率，但多數(shù)患者因體內(nèi)殘留的瘤細(xì)胞而使疾病復(fù)發(fā)。異基因干細(xì)胞移植因患者年齡問題多采用非清髓移植方式，本研究通過異基因CIK細(xì)胞及負(fù)載瘤細(xì)胞抗原的DCCIK細(xì)胞證實了兩種培養(yǎng)細(xì)胞均對骨髓瘤細(xì)胞U266有殺傷活性，為骨髓瘤自體或非清髓異基因干細(xì)胞移植術(shù)后應(yīng)用CIK或DC-CIK細(xì)胞清除體內(nèi)殘留的瘤細(xì)胞以減少疾病復(fù)發(fā)提供理論和實驗依據(jù)。LDH釋放法檢測結(jié)果顯示:負(fù)載瘤細(xì)胞抗原的DCCIK細(xì)胞對U226細(xì)胞的殺傷活性在相同效靶比時比單獨CIK細(xì)胞更強(qiáng)，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

CIK細(xì)胞為一異質(zhì)細(xì)胞群，大于90%表達(dá)CD3，這其中包括約35%共表達(dá)CD 56的細(xì)胞[2]。CIK細(xì)胞輸注首先要保證質(zhì)量及數(shù)量，應(yīng)減少或避免傳染疾病的機(jī)會，常規(guī)的來源以自體外周血居多，經(jīng)過體外培養(yǎng)后CD3+CD56+細(xì)胞能夠大量擴(kuò)增，而在未培養(yǎng)的外周血中含量極少，只有1% ～5%。在培養(yǎng)2～3周后，CIK細(xì)胞比例可由0.1% ～0.13%上升至19%～20.5%，細(xì)胞數(shù)量平均增加25倍(2.2～525倍)。我們培養(yǎng)的CIK細(xì)胞表型與文獻(xiàn)相似，與以往的LAK、CD3AK細(xì)胞相比，CIK細(xì)胞擴(kuò)增能力及殺傷活性均有提高。CIK細(xì)胞既有T淋巴細(xì)胞的抗腫瘤特性，又有NK細(xì)胞的非MHC限制性殺瘤特點，對很多腫瘤均有殺傷活性，很多研究也已證實了該活性，如對結(jié)腸癌SW620和LOVO細(xì)胞株;鼻咽癌 CNE-1、CNE-2Z、NP69 細(xì)胞株;腎癌 A704;宮頸癌、卵巢癌等，且對自體和異體腫瘤等均有較好的抗瘤效果。CIK細(xì)胞作用機(jī)理在于可分泌穿孔素(Perforin)及顆粒酶(Granzyme)殺傷靶細(xì)胞;同時CIK細(xì)胞活化后可分泌多種細(xì)胞因子，如IL-2，TNF-α，IFN-γ等，不僅可直接殺傷腫瘤細(xì)胞，還可通過對機(jī)體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)來間接殺傷腫瘤細(xì)胞[3]。Introna等[4]做了異基因(供者)CIK治療異基因造血干細(xì)胞移植后復(fù)發(fā)病例的Ⅰ期臨床研究:移植后復(fù)發(fā)的11例患者入組，治療后1例病情穩(wěn)定，1例血液學(xué)情況改善，3例完全緩解，結(jié)果令人鼓舞。

DC是已知功能最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞(APC)，存在于除腦組織外的所有組織器官中，與B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、活化的T淋巴細(xì)胞等其它APC不同的是，DC是唯一能刺激初始T淋巴細(xì)胞增殖的APC，是機(jī)體免疫反應(yīng)的始動者。DC通過MHCⅡ類分子途徑激活初始CD4+T細(xì)胞，DC也能直接向CD8+CTL呈遞抗原，CD4+和CD8+T 細(xì)胞通過共同分泌細(xì)胞因子或直接殺傷腫瘤細(xì)胞而產(chǎn)生抗腫瘤反應(yīng)[5]。DC在體內(nèi)的數(shù)量極少，占人外周血單個核細(xì)胞的1%以下，體外分離腫瘤抗原脈沖DC，使其致敏得到DC瘤苗，該瘤苗進(jìn)入體內(nèi)不僅保證腫瘤抗原被有效攝取、呈遞，還可提供攻擊腫瘤細(xì)胞必需的共刺激分子，能夠結(jié)合并殺傷腫瘤細(xì)胞[6]。負(fù)載腫瘤抗原DC細(xì)胞與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)取得更強(qiáng)殺傷活性，估計與CIK細(xì)胞不均質(zhì)，部分CD8細(xì)胞被激活有關(guān)。

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