重組hcmvIL-10的表達純化及免疫抑制活性研究①

曾 智 高 艷 馮晶晶 田可港 浮 苗 彭 穎 鄭曉群

(溫州醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院，溫州325027)

人巨細胞病毒(Human cytomegalovirus，HCMV)是皰疹病毒科β屬雙股線性DNA病毒。發(fā)達國家人群HCMV的感染率為40% ～60%，而發(fā)展中國家?guī)缀踹_到100%，且多在嬰幼兒時期發(fā)生[1]。HCMV是胎兒宮內(nèi)感染和圍產(chǎn)期感染的重要病原，也是引起嬰幼兒和免疫力低下個體的主要病原體之一。HCMV感染具有潛伏-激活的生物學特性，其侵入人體后可通過多種途徑逃避宿主的免疫監(jiān)視和防御功能，在體內(nèi)潛伏或呈低度復制，從而長期或終身存在于宿主體內(nèi)。

HCMV自身可編碼多種蛋白，從多個水平干擾宿主的免疫應答，或調(diào)節(jié)病毒DNA的復制，有利于宿主細胞內(nèi)潛伏。研究表明[2]，HCMV病毒基因組中存在與人類白細胞介素10(Interleukin-10，IL-10)序列同源性的區(qū)域，編碼IL-10同源類似物，即人巨細胞病毒編碼的IL-10同源類似物(hcmvIL-10)。hcmvIL-10與人白細胞介素10(hIL-10)有27%同源性，可與 IL-10 受體(IL-10R)相互作用[3，4]，具有 IL-10的許多重要功能:如抑制細胞因子的合成，干擾細胞表面MHC的表達和調(diào)節(jié)細胞介導的細胞毒性反應等[5]。因此，為了研究 hcmvIL-10在HCMV潛伏-激活感染中的作用機制及其與hIL-10的功能差異，我們表達純化了hcmvIL-10和hIL-10重組蛋白，探討并比較二者對單核細胞的免疫抑制活性及分化相關(guān)基因表達的差異，為進一步深入研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 pMal-c2X-hcmvIL-10和pMal-c2X-hIL-10菌株由本實驗室保存;THP-1細胞購自中國科學院上海細胞庫;蛋白質(zhì)分子量標準(低)、100 bp DNA Ladder Marker、PCR 試劑、RT-PCR試劑盒、QPCR試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司;功能分類Th1-Th2-Th3 PCR ARRAY購自美國Super-Array公司(PAHS-034A);β-巰基乙醇(2-ME)購自美國Gibco公司;Amylose柱及抗MBP抗體購自美國NEB公司;Trizol Reagent、DEPC水購自上海捷瑞生物工程有限公司;ELISA試劑盒購自北京四正柏生物技術(shù)有限公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)、二甲基亞砜(DMSO)、雙抗(青霉素/鏈霉素)、細胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿、羊抗兔HRP-IgG抗體、DAB顯色試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所;蛋白質(zhì)預染Marker購自Fermentas公司;RPMI1640培養(yǎng)液購自Hyclone公司;特級胎牛血清購自天津TBD公司;Anti-Human HLA-DR PE、Mouse IgG2b κ Isotype Control PE購自eBioscience公司。

1.2 方法

1.2.1 重組hcmvIL-10的誘導表達及純化 將重組表達質(zhì)粒pMal-c2X-hcmvIL-10(同時構(gòu)建hIL-10重組表達質(zhì)粒pMal-c2X-hIL-10作為實驗對照，本實驗室已構(gòu)建)轉(zhuǎn)化受體菌E．coli BL21(DE3)中，以含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板篩選，37℃培養(yǎng)過夜，經(jīng)IPTG誘導表達目的蛋白。表達條件的優(yōu)化:分別采用不同IPTG 終濃度(0.05、0.1、0.5、1 mmol/L)，不同時間(1、3、5、7 小時)進行誘導表達，收集細菌沉淀超聲破碎，進行SDS-PAGE電泳，比較不同條件下融合蛋白表達情況，以選擇最佳的誘導條件。

離心收集誘導表達的菌體，超聲破碎后，取上清用Amylose-resin親和層析對含MBP標簽的蛋白進行初步純化。根據(jù)分子量的大小采用葡聚糖凝膠(Sephadex G-75)層析進行二次純化，并經(jīng) SDS

PAGE電泳鑒定。

1.2.2 重組蛋白的Western blot鑒定 將純化后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后加入(1∶1 000)的抗MBP抗體4℃過夜，洗膜后加(1∶1 000)的 HRP-羊抗鼠IgG于室溫溫育1小時，再次洗膜后以DAB試劑盒進行顯色。

1.2.3 細胞培養(yǎng)上清液TNF-α檢測 取對數(shù)生長期THP-1細胞，計數(shù)后鋪板，使細胞密度為0.5×106ml-1，每孔加1 μl PHA，然后加入重組 hcmvIL-10和hIL-10使其終濃度分別為0、2、10和50 ng/ml，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時后，收集細胞培養(yǎng)液，1 000 r/min×10分鐘離心去除顆粒和聚合物。每個樣品設(shè)2個復孔，每孔加100 μl上清液，37℃孵育90分鐘后，洗滌4次;加生物素化抗體工作液(100 μl/孔)，37℃ 孵育 60 分鐘，洗滌 4 次;加酶結(jié)合工作液(100 μl/孔)，37℃孵育30分鐘，洗滌4次;加顯色劑100 μl/孔，避光，37℃孵育20分鐘后，加終止液100 μl/孔，混勻后測量OD450值。根據(jù)標準曲線計算出樣品中TNF-α含量，實驗重復3次。

1.2.4 THP-1細胞HLA-DR表達檢測 取對數(shù)生長期THP-1細胞，計數(shù)后鋪板，使細胞密度為0.5×106ml-1，每孔加重組hcmvIL-10和hIL-10使其終濃度分別為0、2、10、50 ng/ml，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時后，提取細胞總RNA，實時熒光PCR檢測HLA-DR mRNA表達。具體步驟:將孔中的THP-1細胞移入1.5 ml離心管，1 000 r/min離心5分鐘，吸去上清，沉淀PBS洗滌3次;每管加Trizol Reagent 1 ml，混勻后室溫放置5分鐘，加200 μl氯仿，振蕩混勻，室溫放置5分鐘，10 000 r/min×15分鐘4℃離心;取上清，加入等體積異丙醇，混勻，室溫放置10分鐘，10 000 r/min×10分鐘4℃離心;向沉淀中加入75%乙醇清洗沉淀，10 000 r/min×5分鐘4℃離心，棄上清，保留沉淀風干;將沉淀溶解于20 μl DEPC水中待用。HLA-DR上游引物:5'-TTGTCTGTTCTGCCTCACTCC-3'，下游引物:5'-GTCAGGATTCAGATAGAACTCGG-3'，擴增片段長度 186 bp;內(nèi)參GAPDH上游引物:5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'，下游引物:5'-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG3'，擴增片段長度185 bp。20 μl反應體系含10 μl SYBR Premix Ex TaqTM(2×)、正反向引物各0.4 μl(20 μl/L)、2 μl cDNA ，加水補充到 20 μl。PCR反應條件:95℃預變性30秒后，95℃變性5秒，56℃退火20秒，72℃延伸40秒，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法，以GAPDH為內(nèi)參，分析基因的相對表達量。同時，另收集上述作用48小時后THP-1細胞，1 000 r/min離心5分鐘，每管加2 ml PBS緩沖液洗滌一次，同型對照組加5 μl Mouse IgG2b κ Isotype Control PE，實驗組加5 μl Anti-Human HLA-DR PE，輕輕混勻，避光30分鐘，每管分別加2 ml PBS緩沖液洗滌細胞一次，再加200 μl PBS重懸細胞，流式細胞儀檢測細胞表面HLA-DR的表達。

1.2.5 采用功能分類PCR ARRAY檢測相關(guān)基因表達譜 取對數(shù)生長期THP-1細胞，計數(shù)后鋪板，使細胞密度為0.5×106ml-1，每孔分別加重組載體、hcmvIL-10和hIL-10蛋白使其終濃度為50 ng/ml，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 48 小時后，收集THP-1細胞提取總RNA，DNaseⅠ 消化RNA樣品，去除其中可能含有的基因組DNA，再次純化RNA并檢測質(zhì)量，合成cDNA，采用功能分類 Th1-Th2-Th3 PCR ARRAY檢測84個基因表達量。具體操作及數(shù)據(jù)分析由上?？党缮锕こ逃邢薰就瓿?。

1.3 統(tǒng)計學分析 用SPSS15.0軟件進行統(tǒng)計分析。各組檢測實驗數(shù)據(jù)經(jīng)方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 重組蛋白的表達純化及Western blot鑒定37℃分別用0.05、0.1、0.5和 1.0 mmol/L IPTG 誘導表達1、3、5和7小時，表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果顯示0.5 mmol/L IPTG在37℃ 誘導5小時能有效地誘導重組蛋白的表達，pMal-c2X的MBP標簽大小約為42.4 kD，hcmvIL-10和hIL-10蛋白的大小分別約為20.1 kD和19.7 kD，加上MBP標簽的大小，結(jié)果與預期吻合(圖1)。重組菌經(jīng)超聲(3秒，15秒，54次)裂解后，12 000 r/min離心10分鐘，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，產(chǎn)物主要存在于菌體超聲破碎物離心后的上清和沉淀中，利用Amyloseresin親和層析柱對含MBP標簽的蛋白進行純化，葡聚糖凝膠G-75(Sephadex G-75)層析進行二次純化，并由SDS-PAGE電泳分析(圖2)。Western blot鑒定可見在大約62.5 kD和62.1 kD處有兩條特異性蛋白條帶(圖3)。

2.2 重組蛋白對PHA誘導THP-1細胞分泌TNF-α的影響 對照組PHA誘導THP-1細胞分泌TNF-α量為(4.20±0.40)pg/ml;不同濃度(2、10、50 ng/ml)重組 hcmvIL-10和 hIL-10作用 PHA誘導的THP-1細胞48小時后，培養(yǎng)上清液中TNF-α濃度分別為:(3.8±0.96)pg/ml、(1.95±0.51)pg/ml、(1.6±0.45)pg/ml和(2.49±0.43)pg/ml、(1.77±0.38)pg/ml、(0.98±0.16)pg/ml，較對照組明顯下降(圖4)，除2 ng/ml hcmvIL-10處理組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，其余各組差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。結(jié)果表明，重組hcmvIL-10能抑制THP-1細胞分泌TNF-α，隨著濃度的增高，抑制作用增強，類似hIL-10的抑制功能。

圖1 純化重組子在大腸桿菌BL21中表達和親和層析純化產(chǎn)物SDS-PAGE電泳分析Fig．1 Expression of purified recombinant in E．coli BL21 and SDS-PAGE electrophoresis analysis of product purified by affinity chromatography

圖2 重組蛋白純化后SDS-PAGE電泳分析Fig．2 SDS-PAGE electrophoresis analysis of recombinant purified protein

圖3 重組蛋白Western blot鑒定圖Fig．3 Identification of recombinant protein with Western blot

圖4 不同濃度重組蛋白對PHA誘導THP-1細胞分泌TNF-α的抑制作用Fig．4 Inhibitiory effect of different concentrations recombinant protein on the TNF-α secretion from THP-1 cells induced by PHA

2.3 重組蛋白對THP-1細胞HLA-DR表達的影響不同濃度(2、10、50 ng/ml)重組 hcmvIL-10、hIL-10與THP-1細胞作用48小時后，THP-1細胞HLADR mRNA相對表達量分別為:0.86±0.025、0.76±0.023、0.75±0.017和0.73±0.017、0.61±0.017、0.55±0.015;HLA-DR分子的表達分別為:(11.5±0.44)%、(10.1±0.30)%、(9.1±0.38)%和(10.9±0.10)%、(9.7±0.50)%、(7.5±0.32)%，與對照組比較，除2 ng/ml重組hcmvIL-10處理組HLA-DR分子表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，其它處理組差異均具有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01，圖5、6)。結(jié)果表明，重組hcmvIL-10能下調(diào)THP-1細胞HLADR的表達，隨著hcmvIL-10濃度的增高，抑制THP-1細胞HLA-DR表達作用增強，與 hIL-10的功能相似。

圖5 不同濃度重組蛋白對THP-1細胞HLA-DR mRNA的抑制作用Fig．5 Inhibitiory effect of different concentrations recombinant protein on HLA-DR mRNA of THP-1 cells

圖6 不同濃度重組蛋白對THP-1細胞表面HLA-DR的抑制作用Fig．6 Inhibitiory effect on THP-1 cells surface HLADR by recombinant protein at different concentrations

2.4 重組蛋白對THP-1細胞相關(guān)基因表達的影響不同重組蛋白(載體、hIL-10和hcmvIL-10蛋白，終濃度為50 ng/ml)與THP-1細胞作用48小時后，分別采用功能分類Th1-Th2-Th3 PCR ARRAY檢測84個基因表達量，以重組載體蛋白為對照，F(xiàn)old絕對值≥2為差異具有統(tǒng)計學意義。結(jié)果顯示:重組hcmvIL-10與hIL-10對THP-1細胞相關(guān)基因的表達存在差異。hcmvIL-10處理組共有8個基因差異表達，上調(diào)基因為 IL-12RB2、NFATC2、SOCS2、TYK2、GFI1和CEBPB，下調(diào)基因為CD80和CTLA4;hIL-10處理組共有5個基因差異表達，上調(diào)基因為SOCS2，下調(diào)基因為 CD80、CD28、CTLA4 和 IL-6(見表1)。

3 討論

病毒在與人類共同進化的過程中產(chǎn)生了大量的基因編碼產(chǎn)物，介入感染宿主的多項生命活動，其目的在于幫助病毒逃避宿主的免疫攻擊，為病毒在宿主細胞中繁殖和復制創(chuàng)造有利的微環(huán)境。HCMV病毒基因組中存在與人IL-10序列同源性的區(qū)域，編碼IL-10同源類似物(hcmvIL-10)，可與IL-10受體(IL-10R)相互作用，具有 IL-10的許多重要功能[4，5]。既往研究顯示 hcmvIL-10 與 IL-10R 相互作用可能是病毒實現(xiàn)免疫逃避的重要策略，但hcmvIL-10在病毒潛伏-激活感染中的具體作用及與hIL-10的功能差異仍不明確。

表1 重組蛋白對THP-1細胞相關(guān)基因表達的影響Tab．1 The effection of recombinant protein on THP-1 cell associated genes expression

重組蛋白的表達根據(jù)目的不同，可選擇可溶性表達或以包涵體形式表達。pMal-c2x載體表達的融合蛋白是可溶性表達，所以無需進行復性，使純化過程更為簡單。由于目的蛋白在構(gòu)建表達載體時，含有編碼麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)(MBP)的大腸桿菌malE基因，在其下游將目的基因插入，從而表達含有MBP的融合蛋白質(zhì)，通過Amylose親和層析柱進行純化，純化后蛋白濃度非常高，同時選用葡聚糖凝膠G-75進行二次純化，滿足后續(xù)蛋白功能方面的研究。

TNF-α是一種具有廣泛生物活性的多功能細胞因子，主要由被激活的巨噬細胞或單核細胞產(chǎn)生，是機體炎癥反應和免疫應答的重要調(diào)節(jié)因子，并參與多種生理和免疫過程。HLA-DR編碼MHCⅡ類分子，主要表達于B細胞、單核巨噬細胞和樹突狀細胞等抗原遞呈細胞上，在免疫應答的始動階段將經(jīng)過處理的抗原片段遞呈給CD4+T細胞。HCMV感染宿主細胞后，MHCⅡ類分子表達下調(diào)將導致CD4+T細胞監(jiān)視感染細胞的能力受損，有利于病毒長期潛伏于宿主細胞內(nèi)。本研究顯示重組hcmvIL-10能不同程度的抑制PHA誘導的THP-1細胞分泌TNF-α，并下調(diào)THP-1細胞HLA-DR的表達。實驗結(jié)果表明，我們表達的蛋白對單核細胞的免疫抑制活性及分化相關(guān)基因表達具有一定的調(diào)節(jié)作用，且在生物學功能上與hIL-10有一定程度的相似性，這可能對HCMV實現(xiàn)免疫逃避和持續(xù)感染有著非常重要的作用。

研究表明hcmvIL-10除了能抑制炎性細胞因子的合成，降低MHCⅡ類分子的表達外，它還能干擾樹突狀細胞(DC)的成熟及其抗原提呈能力，使得DC共刺激分子 CD40、CD80和CD86等的上調(diào)受損[6-8]。我們通過PCR ARRAY檢測了重組hcmvIL-10與THP-1細胞作用后相關(guān)基因表達譜，結(jié)果顯示，重組hcmvIL-10能明顯下調(diào)CD80和CTLA4基因表達，同時明顯上調(diào) IL-12RB2、NFATC2、SOCS2、TYK2、GFI1和CEBPB基因表達;hIL-10明顯下調(diào)CD80、CD28、CTLA4和 IL-6基因表達，上調(diào) SOCS2基因表達。CD80和CD28屬于免疫細胞活化基因，參與激活T細胞，介導協(xié)同刺激信號;SOCS2屬細胞因子信號轉(zhuǎn)導抑制因子，由細胞因子誘導產(chǎn)生，JAK-STAT信號通路中非常重要的負調(diào)控蛋白，通過與細胞因子受體結(jié)合來抑制細胞因子信號轉(zhuǎn)導[9，10]，調(diào)節(jié)機體對細胞因子的過渡刺激，可抑制巨噬細胞或樹突狀細胞的激活;GFI1即獨立生長因子，是一種T淋巴細胞特異的轉(zhuǎn)錄抑制因子[11]。研究結(jié)果表明，重組hcmvIL-10可能通過下調(diào)CD80和CD28基因表達，上調(diào)SOCS2和GFI1基因表達，抑制THP-1細胞的免疫功能。NFAT即活化T細胞核因子，是一類具有多向調(diào)節(jié)功能的轉(zhuǎn)錄因子，參與T細胞的活化過程，在Th0細胞的分化中起重要作用，調(diào)節(jié)Th2細胞因子的產(chǎn)生。NFAT參與T細胞耐受，在免疫無能T細胞中，NFAT信號途徑對T細胞活化起負調(diào)節(jié)作用，下調(diào)T細胞表面受體信號傳遞，抑制細胞因子的產(chǎn)生[12，13]。CEBPB 屬增強子結(jié)合蛋白，與NFAT有正協(xié)同作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，重組hcmvIL-10能顯著上調(diào)NFATC2和CEBPB的表達，NFATC2表達差異達5.73倍，而hIL-10作用不明顯。由此可見，重組蛋白hcmvIL-10作用THP-1細胞后基因表達情況與hIL-10存在差異，引起這些差異的原因可能是:hcmvIL-10雖是hIL-10的同源類似物，但其二者在序列和結(jié)構(gòu)上仍存在一定差別，如hcmvIL-10與hIL-10有27% 同源性，為非連續(xù)性片段，位于HCMV病毒ULlll.A基因附近，有3段外顯子和2個內(nèi)含子，這可能導致二者在與受體結(jié)合及誘導下游信號通路方面存在差異。

綜上所述，重組hcmvIL-10具有一定的生物學活性，能不同程度的抑制THP-1細胞HLA-DR的表達及分泌TNF-α，與hIL-10有很大的相似性。雖然hcmvIL-10和hIL-10在結(jié)構(gòu)和功能上有很大的相似性，但二者引起THP-1細胞中基因表達變化存在差異，進一步通過對這些差異基因的作用及其機制進行研究，有助于HCMV潛伏-激活感染機制的闡明。

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