IFITM3基因的克隆及其在真核細胞中的表達與定位研究①

朱 娜 李 昌 郭 焱 李 沂 孫丹丹 任靜強 杜壽文 秦艷青 王茂鵬 田宇飛 金寧一

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，長春130122)

細胞通過模式識別受體(Pattern recognition receptors，PRRs)識別病原微生物的病原相關(guān)分子模式(Pathogen associated molecular patterns，PAMPs)，誘導(dǎo)信號級聯(lián)反應(yīng)，激活轉(zhuǎn)錄因子，進而激活特定的細胞因子和趨化因子的表達，使機體處于抗感染狀態(tài)。其中最主要的就是誘導(dǎo)干擾素(Interferon，IFN)，特別是Ⅰ型IFN(IFNα/β)的表達。Ⅰ型IFN通過特異性結(jié)合到病毒感染和非感染細胞表面的干擾素受體(Interferon receptor，IFNR)，從而誘導(dǎo)數(shù)百個干擾素刺激基因(Interferon stimulated genes，ISGs)的表達，啟動或調(diào)節(jié)機體的免疫應(yīng)答[1]。在ISGs中，干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白(Interferon-induced transmembrane proteins，IFITMs)是其中較為重要的一種，其表達后除調(diào)節(jié)細胞的粘附、影響細胞分化外，還與體內(nèi)細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤的形成、生殖細胞的歸巢和成熟、骨鹽的沉積以及抗病毒反應(yīng)等活動有關(guān)[2]。

IFITM3是近期發(fā)現(xiàn)的一種具有廣譜抗囊膜病毒活性的蛋白。在人體內(nèi)，IFITM基因家族含有4個成員，即 IFITM1、IFITM2、IFITM3 和 IFITM5[3]。已經(jīng)證實IFITM1、IFITM2和IFITM3可以由Ⅰ型或Ⅱ型IFN誘導(dǎo)產(chǎn)生，它們對甲型流感病毒的多個亞型(H1、H3、H5及H7)都有很強的抑制作用，其中IFITM3的抑制效果最強，同時IFITM3還對登革熱病毒(Dengue Virus)、西尼羅河病毒(West Nile Virus)、SARS-Co冠狀病毒(SARS Coronavirus)、人免疫缺陷病毒(HIV-1)等其他不同類型的病毒均有抑制效果[4-6]。缺失IFITM3后IFN的抗病毒反應(yīng)會明顯變?nèi)?，所以IFITM3在干擾素反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，為人體抗病毒免疫所必需[7]。

為此，我們通過人Ⅰ型 IFN(rhIFNα2B)誘導(dǎo)293T細胞，提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行IFITM3的擴增，并將其構(gòu)建到真核表達載體中，開展其表達與鑒定的研究，該結(jié)果為進一步研究IFITM3基因的功能和生物學(xué)活性以及作用機制奠定了堅實基礎(chǔ)，目前國內(nèi)尚未見相關(guān)研究報道。

1 材料與方法

1.1 細胞、菌種和載體 大腸桿菌E．coli DH5α、人胚胎腎細胞293T由本實驗室保存;pVAX1載體為Invitrogen公司產(chǎn)品;pMD18-T simple Vector為TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.2 主要試劑和儀器 rhIFNα2B干擾素購自Peprotech公司;RIPA裂解液購自Beyotime公司;質(zhì)?；厥赵噭┖匈徸訟xygen公司;質(zhì)粒制備試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司;胎牛血清(FCS)、胰蛋白酶和DMEM培養(yǎng)基購自Hykolong公司;opti-MEM培養(yǎng)液購自Gibco;FuGEENE HD轉(zhuǎn)染試劑購自Roche公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG和FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司;兔源IFITM3 PolyClonal Antibody購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;鼠源Anti-beta-actin Monoclonal Antibody購自聯(lián)科生物;抗熒光猝滅封片液購自碧云天。

英國TECHNE TC512 PCR儀;熒光顯微鏡為Olympus公司產(chǎn)品;Thermo Scientific公司的NANODROP 2000 Spectrophotometer;激光共聚焦顯微鏡為德國Leica公司產(chǎn)品。

1.3 IFITM3基因的擴增 人胚胎腎細胞細胞系293T細胞貼壁培養(yǎng)于含10%新生小牛血清及1%青、鏈霉素的 DMEM 培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2及飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。將指數(shù)生長期的293T細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔接種1×106個細胞，培養(yǎng)過夜。第2天將 rhIFN-α2B稀釋液5 μl(濃度1.33×10-5g/ml)加到細胞培養(yǎng)上清液中，孵育12小時。TRIzol法提取細胞RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行PCR擴增，上游引物:ggggatccgccaccatgaatcacactgtccaaac;下游引物:gggaattcctagtggtggtggtggtggtgtccataggcctggaaga。其中上游引物含有EcoRⅠ酶切位點和kozak序列，下游含BamHⅠ酶切位點及his-tag標(biāo)簽，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系為:cDNA模板 1 μl，2.5 mol dNTP 2.5 μl，rTaq Buffer 2.5 μl，rTaq 1μl，上、下游引物各1 μl，RNase-free 水16 μl，使反應(yīng)體系終體積為25 μl，離心混勻。PCR程序為:95℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性 30秒，56℃退火 30秒，72℃延伸 45秒，擴增30個循環(huán)，72℃后延伸10分鐘，4℃保存。將PCR產(chǎn)物與pMD18-T simple Vector載體連接，命名為pMD-IFITM3，轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)卡那霉素抗性篩選，挑取陽性單菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切初步鑒定正確后，送往北京華大中天生物公司測序。

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切經(jīng)測序正確的pMD-IFITM3，凝膠回收目的片段，并與相同酶切的pVAX1相連，命名為pV-IFITM3，然后轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞，卡那霉素抗性篩選，挑取陽性單菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，并用 BamHⅠ和EcoRⅠ酶切鑒定。

1.5 質(zhì)粒的制備與純化 常規(guī)方法大量制備重組質(zhì)粒pV-IFITM3，詳細操作步驟參見北京百泰克質(zhì)粒大量制備試劑盒說明書。然后測定質(zhì)粒濃度及D260/D280值，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 細胞轉(zhuǎn)染 293T細胞生長至80%～90%融合時，取適量重組質(zhì)粒pV-IFITM3，利用FuGEENE HD轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染，質(zhì)粒和FuGEENE HD比例為3μg質(zhì)粒和8 μl轉(zhuǎn)染試劑，孵育8小時，設(shè)載體pVAX1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染細胞作為陰性對照。

1.7 IFITM3的RT-PCR檢測 采用TRIzol法提取細胞總RNA，RT-PCR擴增IFITM3基因，鑒定基因的轉(zhuǎn)錄情況。IFITM3引物及擴增方法參照1.3進行。

1.8 Western blot檢測IFITM3在293T細胞中的表達 重組質(zhì)粒pV-IFITM3轉(zhuǎn)染293T細胞，方法同1.6，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48小時后，提取細胞蛋白，取2 μl細胞蛋白提取液用分光光度計測定樣品蛋白含量，測蛋白濃度 ＞5 mg/ml。取蛋白樣品(600 μg)按4∶1溶于5×loading buffer樣品上樣緩沖液中，混勻，沸水煮沸10分鐘，15%SDS-PAGE凝膠電泳，將分離的蛋白電轉(zhuǎn)移至NC(0.45 μm)膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2小時，然后分別與5%脫脂奶粉2 000×稀釋的IFITM3抗體4℃孵育12小時，PBST洗滌3次，每次5分鐘，加入5%脫脂奶粉2 000×稀釋的二抗室溫孵育3小時，用PBST漂洗3次，每次10分鐘，化學(xué)發(fā)光ECL法顯影檢測IFITM3表達，并以β-actin作為內(nèi)參照。

1.9 重組蛋白的激光共聚集檢測 將指數(shù)生長的293T細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，孔底附有玻片，每孔接種1×106個細胞，培養(yǎng)至細胞生長80% ～90%融合時，進行轉(zhuǎn)染實驗，方法同1.6，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24小時，待細胞生長到接近長滿單層時，取出玻片，用 PBS液沖洗 3次，分析純甲醇(-20℃)固定30分鐘，再用 PBS液洗滌3次，用5%脫脂奶粉封閉2小時，PBS液沖洗3次，每次5分鐘，加入5%脫脂奶粉2 000×稀釋的IFITM3一抗，室溫作用2小時后，PBS液沖洗3次，加入5%脫脂奶粉200×稀釋的FITC標(biāo)記羊抗兔IgG和200×稀釋的0.05%的伊文氏蘭(終濃度0.025%)，室溫避光作用2小時，沖洗3次，吸干，滴加抗熒光猝滅封片劑，倒置于載玻片上，激光共聚焦顯微鏡觀察、照相。FITC所用激發(fā)波長為488 nm，在圖像分析系統(tǒng)中選擇目標(biāo)區(qū)域取圖，并做Z軸方向的光切片合成。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的獲得 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，rhIFN-α2B處理的293T細胞提取RNA，RT-PCR擴增后，在400 bp處可見明顯的擴增條帶(圖1A)，擴增片段的電泳結(jié)果與理論值相符，證明得到IFITM3基因。將IFITM3克隆入pMD18-T載體上，經(jīng)BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切，凝膠電泳結(jié)果顯示，在400 bp和3 100 bp處可見明顯條帶(圖1B)，證明IFITM3片段已連接至T載體中。測序結(jié)果如圖2示，與Gen-Bank中 IFITM3完全一致，證明成功獲得 IFITM3基因。

2.2 重組質(zhì)粒pV-IFITM3的鑒定 質(zhì)粒pV-IFITM 3經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，可見400 bp左右的目的條帶(圖3)，表明構(gòu)建成功。

2.3 RT-PCR鑒定IFITM3基因在293T細胞中的轉(zhuǎn)錄 提取轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pV-IFITM3的293T細胞的mRNA，經(jīng)RT-PCR擴增IFITM3，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，RT-PCR擴增后在400 bp處有明顯條帶，但是在空載體pVAX1及陰性細胞對照中也同樣出現(xiàn)目的條帶(圖4A)，表明293T細胞含有內(nèi)源性IFITM3的表達，但與轉(zhuǎn)染IFITM3的質(zhì)粒相比，條帶較弱，表明IFITM3基因在293T細胞中獲得轉(zhuǎn)錄，設(shè)β-actin為內(nèi)參對照(圖4B)。

圖1 IFITM3擴增及pMD-IFITM3質(zhì)粒酶切鑒定Fig．1 Amplification of IFITM3 and restriction enzyme digestion of pMD18-T-IFITM3

圖2 IFITM3的核酸與氨基酸序列Fig．2 Nucleic acid and amino acid sequence of IFITM3

圖3 pV-IFITM3質(zhì)粒酶切瓊脂糖凝膠電泳Fig．3 Agarose gel of pV-IFITM3 restriction enzyme digestion

圖4 IFITM3基因的mRNA轉(zhuǎn)錄檢測Fig．4 mRNA transcription identification of IFITM3 gene

2.4 IFITM3基因表達蛋白的免疫印跡檢測 利用Western blot對轉(zhuǎn)染pV-IFITM3質(zhì)粒的293T細胞蛋白進行表達鑒定?；瘜W(xué)發(fā)光ECL法顯影檢測結(jié)果如圖5所示，樣品1和2在17 kD有明顯條帶，表明IFITM3基因在293T細胞中表達，且具有良好的抗體結(jié)合能力。另外，該結(jié)果與轉(zhuǎn)錄水平的檢測有所不同，未能檢測到內(nèi)源性IFITM3蛋白水平的表達。表明內(nèi)源性IFITM3存在mRNA水平的表達，但其由于某種原因不能夠翻譯成蛋白或翻譯后很快被降解，從而在蛋白水平檢測不到，但具體原因有待于更進一步研究。

2.5 IFITM3蛋白的定位 利用間接免疫熒光結(jié)合激光共聚集對轉(zhuǎn)染pV-IFITM3質(zhì)粒后293T細胞表達的IFITM3蛋白進行定位研究。由圖6可以看出，IFITM3基因轉(zhuǎn)染293T細胞48小時后，表達的外源蛋白主要分布于細胞膜上。

圖5 IFITM3基因轉(zhuǎn)染293T細胞48小時后蛋白Western blot檢測Fig．5 Western blot analysis of the expression of the 48 h protein of 293T cell transfected by IFITM3 gene

圖6 IFITM3基因轉(zhuǎn)染293T細胞48小時后蛋白免疫熒光檢測Fig．6 IFA analysis of the expression of the 48 h protein of 293T cell transfected by IFITM3 gene

3 討論

干擾素(IFN)是一類重要的具有生理功能的細胞因子，其不僅可以調(diào)節(jié)機體的免疫反應(yīng)，而且可干擾病毒的復(fù)制，被廣泛應(yīng)用于疾病的預(yù)防與治療。但干擾素本身沒有直接的抗病毒作用，其主要通過與細胞的干擾素受體(IFNR)結(jié)合，從而誘導(dǎo)大量的干擾素刺激因子(ISGs)的表達，通過這些產(chǎn)生的ISGs達到抗病毒的目的。干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白(IFITM)就是ISGs中的一類。在人體中已發(fā)現(xiàn)的4個IFITMs中(IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5)，除 IFITM5在骨鹽沉積中的作用研究的比較清楚外，其他三個IFITMs的研究還不夠深入[8]。近期研究表明，IFITM3在抑制大多數(shù)囊膜病毒早期感染過程中發(fā)揮著重要作用，過表達IFITM3能夠抑制病毒感染，敲低或敲除IFITM3后，病毒對細胞的敏感性顯著增強，進一步研究表明，IFITM3系干擾素發(fā)揮抗病毒活性所必需，但IFITM3如何抑制病毒感染卻不清楚[9，10]。因此，開展 IFITM3 相關(guān)研究，將為更好地理解病毒與宿主之間的關(guān)系提供重要線索，為此類分子的抗病毒臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

本研究著眼于IFITM3基因的克隆及其在真核細胞中的表達與定位，利用人干擾素α2B(rhIFN-α2B)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人胚腎293T細胞，采用RTPCR技術(shù)擴增獲得干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白IFITM3全長cDNA，將IFITM3基因亞克隆至真核表達載體pVAX1中獲得重組表達質(zhì)粒pV-IFITM3，轉(zhuǎn)染293T細胞。RT-PCR檢測結(jié)果表明，IFITM3得到正確轉(zhuǎn)錄，同時空載體轉(zhuǎn)染組、未轉(zhuǎn)染組均出現(xiàn)IFITM3 mRNA的表達，但轉(zhuǎn)染組mRNA的表達量明顯高于對照組，表明在293T細胞中存在內(nèi)源性IFITM3在轉(zhuǎn)錄水平的表達。進一步蛋白水平的免疫印跡檢測結(jié)果顯示，只有轉(zhuǎn)染含有目的基因質(zhì)粒(pVAX1-IFITM3)出現(xiàn)目的條帶，而對照組無，一方面表明構(gòu)建的目的基因可以成功表達且具有抗原活性。另一方面也說明雖然靜息的293T細胞中存在IFITM3 mRNA的表達，但由于某種原因其不能翻譯為蛋白，或者翻譯的蛋白量少，或者蛋白翻譯后被快速降解，致使在轉(zhuǎn)染48小時后不能檢測到，但具體原因有待于進一步研究。該研究提示，在人類正常細胞中即使存在IFITM3內(nèi)源性mRNA的表達，但由于其不能夠進一步大量翻譯為具有生物功能的蛋白，從而限制了其抗病毒活性的發(fā)揮，所以導(dǎo)入外源性的IFITM3，將有可能改變這一現(xiàn)狀，從而為新型抗病毒藥物的研制以及轉(zhuǎn)基因抗病毒育種研究提供了重要線索。

在進行IFITM3的定位實驗中，選用轉(zhuǎn)染24小時后的細胞蛋白進行FITC抗體標(biāo)記檢測，激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，IFITM3為遍在表達(結(jié)果略)，這與之前其他人研究結(jié)果相同[4-6]，但到48小時后，IFITM3蛋白大都集中于細胞膜上，其機制還需要深入探討。

總之，本研究在國內(nèi)率先成功獲得了人源的IFITM3基因，并在真核細胞中進行了表達，RT-PCR、Western blot均表明該基因能夠表達，且具有良好抗原活性;激光共聚焦顯微鏡觀察，IFITM3基因在后期主要分布于細胞膜上，該研究為基于IFITM3的抗病毒藥物研發(fā)以及探討其抗病毒機制研究奠定了堅實基礎(chǔ)。

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