阿爾茲海默病小鼠模型的磁共振影像學(xué)分析

朱 皓，高 凱，張連峰，2

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021;2.國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種在世界范圍內(nèi)老年人高發(fā)病率的神經(jīng)退行性變性疾病，其基本的病理學(xué)改變是腦組織中老年斑、神經(jīng)原纖維纏結(jié)以及神經(jīng)元的丟失［1］。AD病人臨床上主要表現(xiàn)為記憶力障礙、認(rèn)知功能減退。由于目前阿爾茨海默病發(fā)現(xiàn)時(shí)多為中、晚期，此時(shí)缺乏根本有效的治療方法，治療將更為困難，因此對(duì)阿爾茨海默病的早期診斷、提高診斷的敏感性和準(zhǔn)確性顯得尤為重要。但到目前為止，在AD病理發(fā)展過程中得到的研究結(jié)果也不是很一致［2－4］。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的發(fā)展，使得人們可以短時(shí)間內(nèi)在動(dòng)物模型上縱向研究MRI標(biāo)志物與病理發(fā)展的關(guān)系。

磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)技術(shù)以其高組織對(duì)比度、可任意方向成像、無顱骨偽影干擾等特點(diǎn)，為提高AD診斷的敏感性和特異性提供了方法。特別是近年來高場(chǎng)強(qiáng)(≥7.0 T)MRI的出現(xiàn)以及飛速發(fā)展的磁共振功能成像技術(shù)，如擴(kuò)散加權(quán)成像(diffusion-weighted imaging，DWI)、擴(kuò)散張量成像(diffusion tensor imaging，DTI)等的應(yīng)用，為阿爾茨海默病的早期診斷研究提供了條件［5，6］。

本研究利用7.0 T高場(chǎng)磁共振成像技術(shù)，分別對(duì)不同年齡的小鼠癡呆模型(APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠)進(jìn)行了磁共振常見參數(shù)T2弛豫時(shí)間、擴(kuò)散加權(quán)成像中的表觀擴(kuò)散系數(shù)(apparentdiffusion coefficient，ADC)值［5］以及擴(kuò)(彌)散張量成像中的各向異性分?jǐn)?shù)(fractional anisotropy，F(xiàn)A)值［6］等參數(shù)變化，為進(jìn)一步利用磁共振技術(shù)來研究AD進(jìn)行了探索。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及設(shè)備

本實(shí)驗(yàn)采用 1、3、5、7、9和 11個(gè)月齡的健康雄性AD轉(zhuǎn)基因小鼠模型APPswe/PSENldE9每個(gè)月齡各6只及同齡雄性野生型(wild type，WT)小鼠每個(gè)月齡各6只;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由本實(shí)驗(yàn)室提供(SCXK(京)2009-0007)。

利用本實(shí)驗(yàn)室的Varian 7.0 T磁共振成像設(shè)備(Varian，Palo Alto，CA)進(jìn)行圖像掃描。本實(shí)驗(yàn)方案已經(jīng)得到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為ILAS-GC-2012-001。

1.2 MRI圖像掃描

掃描前采用1.5%～2%異氟烷和氧氣混合氣體對(duì)小鼠進(jìn)行吸入麻醉(Visualsonics，Canada)。當(dāng)小鼠完全麻醉后，將小鼠俯臥位固定于掃描床上。用Varian 7.0 T/160 mm磁共振儀，選用小鼠頭顱線圈接收，依次進(jìn)行小鼠大腦橫斷位快速自旋回波(Fast Spin Echo，F(xiàn)SE)序列 T2加權(quán)成像(T2weighted imaging，T2WI)掃描，多回波自旋回波(multiple spin echo，MSE)序列掃描并進(jìn)行后處理獲得 T2map，擴(kuò)散加權(quán)成像(DWI)序列以及擴(kuò)散張量成像(DTI)序列的掃描。

(1)FSE-T2WI掃描參數(shù)如下:TR=2 500 ms，TE=60 ms，ETL=8，F(xiàn)OV=20 mm ×20 mm，層厚/間距(Thk/Gap)=0.8mm/1.0mm，采樣矩陣(matrix)=256×512;重復(fù)次數(shù) (NEX)=4。

(2)MSE-T2map 掃描參數(shù):TR=2 000 ms，TE=10 ms、20 ms、30 ms、40 ms、50 ms、60 ms、70 ms、80 ms，F(xiàn)OV=20 mm ×20 mm，層厚(Thk)=0.8 mm，采樣矩陣(matrix)=256×256，重復(fù)次數(shù)(NEX)=2。

(3)DWI掃描參數(shù):TR=2 000 ms，TE=37 ms，擴(kuò)散梯度持續(xù)時(shí)間(δ)=5 ms，擴(kuò)散梯度間隔(Δ)=15 ms，擴(kuò)散敏感系數(shù)(b)值 ={13.242 6，120.043，398.604，848.925}/s/mm2，F(xiàn)OV=20 mm×20 mm，層厚(Thk)=0.8 mm，采樣矩陣(matrix)=256 ×256，重復(fù)次數(shù)(NEX)=4。

(4)DTI掃描參數(shù):TR=2 000 ms，TE=36 ms，［Gx，Gy，Gz］=［1，1，0］，［1，0，1］，［0，1，1］，［-1，1，0］，［0，-1，1］和 ［1，0，-1］。擴(kuò)散敏感系數(shù)(b)值=1 000 s/mm2，F(xiàn)OV=20 mm ×20 mm，層厚(Thk)=0.8 mm，采樣矩陣(matrix)=192×192，重復(fù)次數(shù)(NEX)=4。

1.3 參數(shù)測(cè)量及統(tǒng)計(jì)

T2弛豫時(shí)間、ADC值以及FA值的測(cè)量是利用系統(tǒng)自帶的VnmrJ 3.1軟件對(duì)相應(yīng)序列采集到的圖像進(jìn)行擬合。在擬合圖像上手動(dòng)畫出感興趣區(qū)(region of interest，ROI)，本實(shí)驗(yàn)選擇大腦皮層和海馬兩個(gè)部位，在每個(gè)部位分別取3個(gè)大小均等的ROI進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，各腦區(qū)的 T2弛豫時(shí)間、ADC值和FA值用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用 t檢驗(yàn)。用 P＜0.05表示差異的顯著性。

2 結(jié)果

2.1 AD轉(zhuǎn)基因小鼠模型的動(dòng)態(tài)磁共振圖像分析

AD轉(zhuǎn)基因小鼠APP/PSl在4月齡出現(xiàn)行為學(xué)變化，5月齡開始出現(xiàn)老年斑［7］。用磁共振 T2WI圖像對(duì)不同月齡小鼠進(jìn)行分析。結(jié)果顯示1、3、5和7月齡AD轉(zhuǎn)基因小鼠活體腦組織的T2WI成像未見明顯低信號(hào)區(qū)。9月齡AD轉(zhuǎn)基因小鼠頂葉皮層及海馬區(qū)可見少量點(diǎn)狀低信號(hào)區(qū)(圖1(a))，11月齡時(shí)點(diǎn)狀低信號(hào)增多(圖1(b))。對(duì)照組(WT)各月齡小鼠腦組織內(nèi)均未見明顯點(diǎn)狀低信號(hào)區(qū)(圖1(c)和(d))。說明 T2WI圖像可顯示 APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠模型后期變化，而不能顯示早期病理改變。

2.2 AD轉(zhuǎn)基因小鼠模型的T2弛豫時(shí)間對(duì)比分析

用MSE-T2map對(duì)不同月齡小鼠頂葉皮層和海馬區(qū)的T2弛豫時(shí)間進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，在1、3、5月齡APP/PSl轉(zhuǎn)基因小鼠和對(duì)照組皮層和海馬的T2弛豫時(shí)間無明顯差異。而從7月齡到9月齡，APP/PSl轉(zhuǎn)基因小鼠皮層和海馬的T2弛豫時(shí)間有減小的趨勢(shì)，但是隨著年齡增加反而有所上升，與對(duì)照組的差異并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

圖1 小鼠腦組織的T2加權(quán)圖像Fig．1 T2WI analysis of the mouse brains

2.3 AD轉(zhuǎn)基因小鼠模型的ADC值對(duì)比分析

利用DWI序列對(duì)不同月齡小鼠頂葉皮層和海馬區(qū)的ADC值進(jìn)行了對(duì)比分析，圖4結(jié)果顯示在3～5月齡 APP/PSl轉(zhuǎn)基因小鼠頂葉皮層和海馬的ADC值開始出現(xiàn)下降趨勢(shì);而從7月齡，APP/PSl轉(zhuǎn)基因小鼠頂葉皮層和海馬的ADC值明顯減小(圖3和圖4)，并與對(duì)照組有顯著性差異(P≤0.05)。

圖2 小鼠T2弛豫時(shí)間測(cè)定Fig．2 T2relaxation time determination of the mouse brains．

圖3 7月齡小鼠ADC圖像。Fig．3 ADC images of 7-month old mice．

2.4 AD轉(zhuǎn)基因小鼠模型的FA值對(duì)比分析

利用DTI序列對(duì)不同月齡小鼠頂葉皮層和海馬區(qū)的FA值的進(jìn)行了對(duì)比分析，圖5為 DTI重建后的FA圖像，圖5和圖6結(jié)果顯示從5月齡開始APP/PSl轉(zhuǎn)基因小鼠頂葉皮層和海馬區(qū)的FA值明顯減小，并與對(duì)照組有顯著性差異(P≤0.05)。

3 討論

目前臨床對(duì)AD的研究主要集中在海馬容積等形態(tài)學(xué)測(cè)量上，而AD的病理學(xué)表現(xiàn)可能在形態(tài)學(xué)改變之前已經(jīng)出現(xiàn)，因此對(duì)AD腦組織微觀變化的研究顯得尤為重要。

APP/PS1小鼠是本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠模型，是目前能比較好的反映人類AD病理進(jìn)程的一種模型，該模型的特點(diǎn)是在4月齡時(shí)開始出現(xiàn)行為學(xué)變化，5月齡開始出現(xiàn)老年斑，7月齡后出現(xiàn)大量老年斑的沉積［7］。利用該模型進(jìn)行磁共振研究，可以反映不同病理發(fā)展時(shí)期的影像特點(diǎn)。

圖5 5月齡小鼠FA圖像。Fig．5 FA images of the 5-month old mice．

本實(shí)驗(yàn)利用高場(chǎng)強(qiáng)(7.0 T)對(duì) 1、3、5、7、9 和 11個(gè)月齡的健康雄性AD轉(zhuǎn)基因小鼠(APP/PS1)進(jìn)行磁共振掃描。在 T2WI圖像中，9和11月齡該模型小鼠的頂葉皮層和海馬區(qū)在發(fā)現(xiàn)有稀疏的點(diǎn)狀低信號(hào)影，這表示Aβ淀粉樣斑塊中富集鐵質(zhì)，鐵質(zhì)具有順磁性，它會(huì)造成局部磁場(chǎng)不均勻，這種不均勻的局部磁場(chǎng)將會(huì)導(dǎo)致磁共振信號(hào)降低，因而會(huì)在T2WI圖像上表現(xiàn)為黑色的低信號(hào)點(diǎn)。有研究表明FSE-T2WI和梯度回波序列(gradient echo，GRE)-WI都可以體現(xiàn)這種斑塊和周圍組織的對(duì)比［8，9］，相比較而言FSE是在90°射頻激發(fā)脈沖后施加多次180°射頻反轉(zhuǎn)脈沖產(chǎn)生的多次自旋回波信號(hào)，并且對(duì)每個(gè)回波獨(dú)立地進(jìn)行相位編碼，按一定規(guī)律排列于K空間。由于多個(gè)緊鄰的180°脈沖，從而使得磁化率不同所致的相位作用減少，所以FSE的磁化效應(yīng)較低，對(duì)于早期鐵離子沉積較少的Aβ淀粉樣斑塊的敏感度較高。而WI受磁場(chǎng)不均勻的影響較大，因此對(duì)Aβ淀粉樣斑塊的敏感度相對(duì)較低［9］。

圖4 小鼠ADC值測(cè)定Fig．4 ADC value determination of the mouse brains

圖6 小鼠FA值測(cè)定Fig．6 FA value determination of the mouse brains．

對(duì)T2弛豫時(shí)間的測(cè)量結(jié)果進(jìn)行分析，7～9月齡APP/PS1小鼠的T2弛豫時(shí)間逐漸減小的趨勢(shì)。可以推測(cè)的是在早期Aβ淀粉樣斑塊開始形成時(shí)期，老年斑中鐵的含量相對(duì)較少，還不會(huì)對(duì)T2弛豫時(shí)間產(chǎn)生一定的負(fù)性作用，隨著小鼠月齡的增加，腦組織中的Aβ的沉積越來越明顯，Aβ淀粉樣斑塊中的鐵含量也逐漸增多，理論上Aβ與鐵的共同作用會(huì)造成T2弛豫時(shí)間的縮短［11］。但還有其它因素會(huì)影響T2弛豫時(shí)間，如形態(tài)的改變、炎癥以及腦脊液(CSF)空間的擴(kuò)張帶來的在MR圖像中的部分容積效應(yīng)會(huì)使T2弛豫時(shí)間增大［12］。在本實(shí)驗(yàn)中，9～11月齡APP/PS1小鼠的T2弛豫時(shí)間又有所增大，但依然小于對(duì)照組，驗(yàn)證了對(duì)于 APP/PS1模型小鼠，T2弛豫時(shí)間受多重因素影響，并且與正常對(duì)照組無顯著性差異。并且在臨床研究中，AD患者的T2弛豫時(shí)間變化也沒有統(tǒng)一的結(jié)論［2，12］。因此頂葉皮層和海馬區(qū)的T2弛豫時(shí)間并不能作為該模型在這2個(gè)腦區(qū)出現(xiàn)病理改變的早期診斷參數(shù)。

擴(kuò)散加權(quán)成像(DWI)反映的是水分子在腦組織中的擴(kuò)散速率［5］。一般來說，水分子在腦組織中擴(kuò)散行為的改變直接反映了腦組織微觀結(jié)構(gòu)的改變，常用表面擴(kuò)散系數(shù)(ADC)來刻畫水分子的擴(kuò)散能力，即擴(kuò)散速率越快，ADC值越大。本實(shí)驗(yàn)中在3～5月齡APP/PSl轉(zhuǎn)基因小鼠頂葉皮層和海馬區(qū)的ADC值開始降低但和對(duì)照組無明顯差異。而7～11月齡，APP/PSl轉(zhuǎn)基因小鼠頂葉皮層和海馬區(qū)的ADC值明顯減小，并與對(duì)照組有顯著性差異(P≤0.05)。推測(cè)ADC值下降的原因是由于Aβ淀粉樣斑塊形成后，導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)增生，而活化的膠質(zhì)細(xì)胞所分泌的一些大分子物質(zhì)，導(dǎo)致了組織的粘度增加，水分子擴(kuò)散能力下降。同時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的體積和數(shù)目的增多，對(duì)水分子的擴(kuò)散也會(huì)造成阻礙。Mueggler等［13］分析 APP23小鼠腦組織ADC值在早期(5月齡)沒有明顯變化的原因是早期腦內(nèi)的Aβ淀粉樣斑塊是以彌散型的斑塊為主，這種斑塊所導(dǎo)致的膠質(zhì)增生還不是很明顯，所以ADC值變化不大。而到老齡(23月齡)APP23小鼠腦內(nèi)的 Aβ淀粉樣斑塊是以致密型的斑塊為主，能導(dǎo)致明顯的膠質(zhì)增生和神經(jīng)膠質(zhì)炎癥反應(yīng)，這是該小鼠ADC值減少的主要原因。

擴(kuò)(彌)散張量成像(DTI)對(duì)腦白質(zhì)結(jié)構(gòu)的微觀變化(比如脫髓鞘，軸突喪失，神經(jīng)膠質(zhì)過多)和神經(jīng)纖維走向的變化十分敏感［6］，因此可用來對(duì)AD腦白質(zhì)病理變化的機(jī)制進(jìn)行更深入的探討，各向異性分?jǐn)?shù)(FA)體現(xiàn)水分子擴(kuò)散的方向依賴程度，即水分子在沿著神經(jīng)纖維的方向上擴(kuò)散較快，而在垂直于神經(jīng)纖維的方向上擴(kuò)散較慢。當(dāng)水分子以各向同性擴(kuò)散(球形擴(kuò)散)時(shí)，F(xiàn)A=0;擴(kuò)散的各向異性程度越大，F(xiàn)A值越接近1。它是顯示白質(zhì)纖維束是否損傷及損傷程度的敏感指標(biāo)，其值越高提示組織具有更好的方向性和更好的纖維束的黏合程度［14］。本實(shí)驗(yàn)中5～11月齡的APP/PSl轉(zhuǎn)基因小鼠頂葉皮層和海馬的FA值明顯減小，并與對(duì)照組有顯著性差異(P≤0.05)。推測(cè)原因可能是，發(fā)病早期的軸索膜或髓鞘破壞和脫失造成神經(jīng)纖維密度降低，以及膠質(zhì)增生，因而水分子的擴(kuò)散更趨向于各向同性，因此FA值降低。

本實(shí)驗(yàn)利用磁共振成像技術(shù)對(duì) 1、3、5、7、9 和11個(gè)月齡的健康雄性APPswe/PSENldE9小鼠腦組織頂葉皮層和海馬的微觀病變進(jìn)行定量研究，發(fā)現(xiàn)T2WI能夠在9月齡發(fā)現(xiàn)呈點(diǎn)狀低信號(hào)的 Aβ淀粉樣斑塊，但與對(duì)照組相比T2弛豫時(shí)間在整個(gè)研究過程中無明顯差異，不能作為早期檢測(cè)AD病變的參數(shù)。利用功能磁共振成像技術(shù)中的擴(kuò)散加權(quán)成像(DWI)和擴(kuò)(彌)散張量成像(DTI)中的參數(shù) ADC值和FA值，分別發(fā)現(xiàn)頂葉皮層和海馬從7月齡(ADC值)，甚至5月齡(FA值)開始，與對(duì)照組有顯著性差異(P≤0.05)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明7.0T高場(chǎng)強(qiáng)MRI能夠顯示病變出現(xiàn)早期(5月齡)AD轉(zhuǎn)基因小鼠APP/PS1頂葉皮層及海馬FA值的明顯改變，揭示了高場(chǎng)強(qiáng)MRI能夠顯示AD病變出現(xiàn)早期小鼠頂葉皮層及海馬FA值的明顯改變，F(xiàn)A值對(duì)早期癡呆病臨床診斷具有一定的參考價(jià)值。

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