嚙齒動(dòng)物螺桿菌多重PCR檢測(cè)方法的建立

李瑞嬌，馮 潔，謝建云，胡建華，高 誠(chéng)

(1．東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620;

2．上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，上海市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站，上海 201203)

嚙齒動(dòng)物螺桿菌(rodent Helicobacter)屬革蘭氏 陰性菌，通常寄居于嚙齒動(dòng)物消化道內(nèi)，包括盲腸、結(jié)腸以及肝膽管系統(tǒng)［1］。自從1992年首次發(fā)現(xiàn)鼠型螺桿菌以來(lái)，目前已陸續(xù)分離到包括有肝螺桿菌(Helicobacter hepaticus)、膽汁螺桿菌(Helicobacter bilis)、嚙齒類螺桿菌(Helicobacter rodentium)在內(nèi)的至少十三種嚙齒動(dòng)物螺桿菌［2］。嚙齒動(dòng)物螺桿菌的感染會(huì)嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的品質(zhì)，其中肝螺桿菌可自然感染多個(gè)品系小鼠并直接導(dǎo)致急、慢性肝炎的產(chǎn)生，并對(duì) A/JCr小鼠肝癌發(fā)生有促進(jìn)作用［3］，膽汁螺桿菌則易引起各種腸炎疾病，并與肝炎發(fā)生相關(guān)，例如多灶慢性肝炎［4］，而感染嚙齒類螺桿菌也會(huì)導(dǎo)致小鼠肝炎、盲腸結(jié)腸炎等多種腸肝疾病，另外膽汁螺桿菌與嚙齒類螺桿菌的同時(shí)存在，會(huì)引起SCID小鼠腹瀉［5］。因此，若誤將感染螺桿菌的動(dòng)物用于科研或生物安全性評(píng)價(jià)等試驗(yàn)中，較易引起實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)混亂，對(duì)結(jié)果產(chǎn)生較為嚴(yán)重的干擾，甚至引發(fā)更嚴(yán)重的后果［2］。

嚙齒動(dòng)物螺桿菌的診斷檢測(cè)，目前有很多種方法，包括傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法、ELASA、PCR 等［6，7］。PCR診斷是螺桿菌分子診斷最優(yōu)勢(shì)的方法，其因快速、敏感、特異等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛的應(yīng)用，主要有普通 PCR、巢式 PCR、多重 PCR、熒光核酸酶 PCR等［8］。多重PCR是以普通 PCR反應(yīng)體系為基礎(chǔ)，但升級(jí)為同時(shí)加入多對(duì)引物，同時(shí)擴(kuò)增出多條目的片段，以達(dá)到同時(shí)檢測(cè)多種病原體，快速、高效的新型方法［9］。本實(shí)驗(yàn)旨在建立一種敏感、特異、高效的多重PCR方法，以達(dá)到可同時(shí)檢出肝、膽汁、嚙齒類三種螺桿菌的目的，為快速診斷提供良好的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒:分別包含肝、膽汁、嚙齒類三種螺桿菌16S rRNA片段的三種陽(yáng)性質(zhì)粒模板由上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心保存。

1.1.2 試劑:質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，Taq DNA 聚合酶，PCR buffer，Mg2+，dNTP，100 bp DNA ladder marker均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，瓊脂糖購(gòu)自西班牙Bio West公司，GoldViewTM核酸染料購(gòu)自上海賽百盛(SBS)基因技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成:根據(jù)GenBank中已發(fā)表的肝、膽汁、嚙齒類三種螺桿菌16S rRNA序列，參照文獻(xiàn)分別設(shè)計(jì)合成三對(duì)特異性引物［10，11］。

1.2.2 普通PCR:使用質(zhì)粒抽提試劑盒對(duì)本室保存的陽(yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA提取，作為單重PCR的模板進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20 μL，其中包括 PCR buffer、dNTP 200 μmol/L、Taq E 0.15 U、引物各 0.5 μmol/L、模板 3 ng，去離子水補(bǔ)足至 20 μL。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。并將PCR產(chǎn)物回收后純化后測(cè)序，與比對(duì)。

單重PCR的敏感度測(cè)定方法如下:分別測(cè)定肝、膽汁、嚙齒類三種質(zhì)粒模板濃度，將濃度調(diào)整至1 ng/μL，再以此為基礎(chǔ)，進(jìn)行10倍梯度稀釋，終濃度為 1 ng、10－1ng、10－2ng、、10－3ng、10－4ng、10－5ng、10－6ng、10－7ng、10－8ng，各取 1 μL 作為模板，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而測(cè)定單重PCR的敏感度。

1.2.3 多重PCR條件優(yōu)化:根據(jù)單重PCR的反應(yīng)體系，將三對(duì)引物等比混合加入到同一個(gè)反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果對(duì)反應(yīng)條件和體系進(jìn)行優(yōu)化，包括退火溫度，Mg2+濃度，dNTP濃度，引物濃度等。

1.2.4 多重PCR條件電泳檢測(cè):取10 μL PCR產(chǎn)物，在濃度為2%的瓊脂糖凝膠中100 V電壓電泳時(shí)間90 min，以確保不同大小的擴(kuò)增產(chǎn)物可以區(qū)分開(kāi)。目的條帶在凝膠成像系統(tǒng)中分析。

1.2.5 多重PCR特異性檢測(cè);為檢測(cè)引物的特異性，相互之間是否會(huì)產(chǎn)生交叉反應(yīng)，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了如下引物和模板組合，對(duì)多重PCR的特異性進(jìn)行檢測(cè)，具體組合情況見(jiàn)表2。

表1 螺桿菌屬16SrRNA基因PCR擴(kuò)增引物Tab．1 The sequences of primers used to amplify 16SrRNA gene of helicobacters

表2 多重PCR特異性檢測(cè)方法Tab．2 specific multiplex PCR detection method

1.2.6 多重PCR敏感度測(cè)定:取梯度稀釋好的三種質(zhì)粒模板各1 μL加入到已優(yōu)化好的 PCR體系中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)電泳結(jié)果對(duì)多重 PCR體系進(jìn)行敏感度的測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 普通PCR

2.1.1 測(cè)序:將測(cè)序結(jié)果與GenBank所發(fā)表的肝、膽汁、嚙齒類三種螺桿菌序列進(jìn)行對(duì)比，同源性達(dá)99%以上。

2.1.2 敏感度檢測(cè):電泳結(jié)果展示，在單重PCR中肝螺桿菌的敏感度達(dá)到10－6ng，膽汁螺桿菌和嚙齒類螺桿菌的敏感度均達(dá)到10－5ng(圖1－3)。

2.2 多重PCR反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化

圖1 普通PCR肝螺桿菌敏感度Fig．1 Sensitivity test of the PCR for detection H．hepaticus．

根據(jù)上述試驗(yàn)設(shè)計(jì)，我們主要對(duì)退火溫度，Mg2+濃度，dNTP濃度，引物濃度等進(jìn)行了調(diào)整。通過(guò)優(yōu)化以上條件，最終確定最佳退火溫度為52°C(見(jiàn)圖 4)，Mg2+濃度為 2.0 mmol/L(圖 5)，dNTP 濃度為 200 μmol/L(圖 6)，引物濃度為 0.625 μmol/L(圖 7)．

2.3 多重PCR特異性試驗(yàn)

用優(yōu)化好的多重PCR反應(yīng)條件，對(duì)不同的引物和模板組合進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)反應(yīng)都能擴(kuò)增出預(yù)期的目的條帶。加入單一模板時(shí)均只有一個(gè)目的條帶，加入雙模板時(shí)均為兩個(gè)目的條帶，加入三種模板時(shí)，所有三個(gè)目的條帶均能有效擴(kuò)增出。表明本文建立的多重PCR方法對(duì)三種螺桿菌能進(jìn)行有效的擴(kuò)增，具有較好的特異性(圖8)。

2.4 多重PCR敏感性試驗(yàn)

對(duì)優(yōu)化好的多重PCR方法進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，從圖9可以看出肝、膽汁、嚙齒類三種螺桿菌敏感度均可達(dá)到10－5ng，即10 fg。和單重 PCR相比，膽汁螺桿菌和嚙齒類螺桿菌的敏感性相當(dāng)，而肝螺桿菌的敏感性稍低，大約降低了一個(gè)數(shù)量級(jí)。(圖9)

圖2 普通PCR膽汁螺桿菌敏感度Fig．2 Sensitivity test of the PCR for detection H．bilis．

圖3 普通PCR嚙齒類螺桿菌敏感度Fig．3 Sensitivity test of the PCR for detection H．rodentium．

圖4 不同退火溫度對(duì)多重PCR的影響Fig．4 The influence of different Annealing temperature for the multiplex PCR．

3 討論

圖5 不同Mg2+濃度對(duì)多重PCR的影響Fig．5 The influence of different Mg2+concentration for the multiplex PCR．

圖6 不同dNTP濃度對(duì)多重PCR的影響Fig．6 The influence of different dNTP concentration for the multiplex PCR．

文獻(xiàn)顯示［1，2，7，16］，目前我國(guó)的大小鼠已存在不同程度的螺桿菌感染，尤其是肝螺桿菌和膽汁螺桿菌的感染已廣泛存在于實(shí)驗(yàn)室以及一些大小鼠養(yǎng)殖基地。而且已有報(bào)道這類細(xì)菌不僅在人或動(dòng)物的胃炎、消化性潰瘍、胃惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到致病作用，也可能與腸道、膽道、肝臟的炎癥性疾病和一些腫瘤的發(fā)生相關(guān)［17］。但嚙齒動(dòng)物螺桿菌感染的動(dòng)物大多數(shù)以慢性、潛伏性感染為主［7］，無(wú)明顯癥狀，故對(duì)嚙齒動(dòng)物是否攜帶菌種的觀察及檢測(cè)造成了一定難度。因此，建立一種快速、敏感、特異的診斷方法顯得尤為重要。

圖7 不同引物濃度對(duì)多重PCR的影響Fig．7 The influence of different primer concentrations the multiplex PCR．

圖8 多重PCR特異性Fig．8 Specificity test of the multiplex PCR detection．

多重PCR作為一種快速省時(shí)，特異性強(qiáng)，靈敏度高而且較為可靠的病原檢測(cè)方法，近年來(lái)在很多領(lǐng)域都有著較為廣泛的應(yīng)用，尤其體現(xiàn)在對(duì)各種病原微生物的檢測(cè)。高正琴、張強(qiáng)［18］等建立的肝螺桿菌多種毒力基因的多重PCR檢測(cè)方法，不僅解決了肝螺桿菌體外培養(yǎng)的困難，操作也較傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)分離培養(yǎng)法大幅度簡(jiǎn)化，為其后續(xù)大規(guī)模檢測(cè)應(yīng)用中節(jié)省了大量時(shí)間。李晨等［19］通過(guò)對(duì)水產(chǎn)病原菌的多重PCR檢測(cè)認(rèn)為，相比一般的生化檢測(cè)方法，多重PCR明顯的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)為省時(shí)、靈敏，但對(duì)比特異性和敏感度同樣優(yōu)異的基因芯片技術(shù)，多重PCR的前期材料準(zhǔn)備簡(jiǎn)單和成本較低在實(shí)踐應(yīng)用中更便于廣泛推廣。另外，細(xì)菌學(xué)多重PCR檢測(cè)普遍顯示［8-11］，針對(duì)免疫學(xué)交叉反應(yīng)較為明顯的干擾，多重PCR的單管操作對(duì)特異性結(jié)果的顯示更為精準(zhǔn)。通過(guò)大量與形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)等方法比較的實(shí)驗(yàn)結(jié)果明確展示［16-20］，多重PCR方法是一種值得推廣，具有較好發(fā)展前景的病原檢測(cè)方法。

圖9 多重PCR敏感度分析Fig．9 Sensitivity test of the multiplex PCR for detection H．hepaticus，H．bilis，H．rodentium．

本實(shí)驗(yàn)建立的肝、膽汁、嚙齒類三種螺桿菌多重PCR檢測(cè)方法，能夠快速而準(zhǔn)確地檢測(cè)嚙齒動(dòng)物回盲內(nèi)容物中是否存在上述三種螺桿菌，該方法不僅具備了普通PCR準(zhǔn)確、敏感的優(yōu)勢(shì)，而且大大提高了檢測(cè)效率，節(jié)省了試劑，為大范圍的流行病學(xué)調(diào)查提供了技術(shù)支持。

多重PCR方法建立很重要的一步在于PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，據(jù)文獻(xiàn)查閱以及預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定對(duì)多重PCR影響較大的條件主要包括退火溫度，Mg2+濃度，dNTP濃度，引物濃度，其中退火溫度的優(yōu)化又更為重要，退火溫度的測(cè)定，直接決定了PCR反應(yīng)的結(jié)果［12-15］。退火溫度過(guò)高或過(guò)低，都會(huì)導(dǎo)致后續(xù)條件優(yōu)化的困難以及菌種檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)以上幾種條件分別進(jìn)行單一變量?jī)?yōu)化，最終獲得了最佳擴(kuò)增效果。

在PCR方法建立過(guò)程中，特異性的驗(yàn)證也是必不可少的一環(huán)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)不同的引物和模板組合進(jìn)行交叉檢驗(yàn)，結(jié)果證明了本文構(gòu)建的多重PCR方法特異性完全符合要求。

另外，在對(duì)多重PCR敏感度的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，建立的該多重PCR體系對(duì)肝、膽汁、嚙齒類三種螺桿菌的敏感度分別為10 fg、10 fg、10 fg，而在此前進(jìn)行的普通PCR中三種螺桿菌的敏感度分別為1fg、10fg、10fg。兩組數(shù)據(jù)對(duì)比可發(fā)現(xiàn)，構(gòu)建的多重 PCR中各對(duì)引物擴(kuò)增時(shí)的互相競(jìng)爭(zhēng)并不明顯，故采用多重PCR也可得到較為良好的效果。由此可見(jiàn)，該多重PCR方法具有可行性。

通過(guò)多種比較，可表明，本文建立的螺桿菌多重PCR檢測(cè)方法具有高效、敏感、特異的優(yōu)點(diǎn)，可以應(yīng)用在嚙齒動(dòng)物螺桿菌檢測(cè)中。

［1］ 陳錫福，李紅．嚙齒動(dòng)物螺桿菌研究現(xiàn)狀［J］．中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)．2008，16(6):238－242．

［2］ 張麗芳，劉星，李紅．嚙齒類螺桿菌的分離鑒定［J］．中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2007，15(3):215－219．

［3］ Ward JM，F(xiàn)ox JG，Anver MR，et al．Chronic active hepatitis and associated liver tumors in mice caused by a persistent bacterial infection with a novel Helicobacter species［J］．Natl Cancer Inst，1994，86(16):1222－1227

［4］ Fox JG，Rogers AB，Whary MT，et al．Helicobacter bilis associated hepatitis in outbred mice［J］．Comp Med，2004，54(5):571－577．

［5］ Whary MT， FoxJG． Detection， eradication， and research implications of Helicobacter infections in laboratory rodents［J］．Lab Animal，2006，35(7):25 －36．

［6］ 張麗芳，劉星，李紅．嚙齒類螺桿菌不同檢測(cè)方法的比較［J］．中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2008，18(5):62－65．

［7］ 王建飛．嚙齒動(dòng)物的一種新病原體—螺桿菌(Helicobacter)研究概況［J］．上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，1996，16(2):108－110．

［8］ Poynter S，Phipps JD，Poynter S，Naranjo-Pino A，et al．Difficulties in the molecular diagnosis of helicobacter rodent infections［A］．Vet Microbiol．2006，134:272 －278．

［9］ 許一平，成煒，邵彥春，等．沙門菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的多重PCR檢測(cè)［J］．微生物學(xué)通報(bào)，2006，33(6)89－94．

［10］ Goto K，Ohashi H，Takakura A．Current status of Helicobacter contamination of laboratory mice，rat，gerbils，and house musk shrews in Japan ［J］．Cur Microbiol，2000，41(6):161 －166．

［11］ Lela KR， Craig LF， ReuelRH． Identification ofmurine Helicobacter by PCR and restriction enzyme analyses［J］．J Clin Microbiol，1996，34:942 －946．

［12］ 黃銀花，胡曉湘，徐慰倬，等．影響多重PCR擴(kuò)增效果的因素［J］．遺傳，2003，25(1):65－68．

［13］ Chambercian JS， JibbsRA， RanierJE， etal． Detection screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via mutiplex DNA amplification ［J］．Nucl Acids Res．1998(16):1141－1156．

［14］ Herbergs JM，Siwek APMA，Crooijmans J，et al．Mutilcolour fluorescent detection and mapping of AFLP makes in chicken［J］．Animals Genetics．1999，30:274 － 285．

［15］ 鄭景生，呂蓓．PCR技術(shù)及實(shí)用方法［J］．分子植物育種．2003，3(1):381－394．

［16］ 丁聰，馮潔，謝建云，等．兩種方法對(duì)上海及周邊地區(qū)飾演大小鼠螺桿菌攜帶情況的調(diào)查［J］．中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志．2011，21(12):66－69．

［17］ Zenner L．Pathology，diagnosis and epidemiology of the rodent Helicobacter infection ［J］．Comp Immunol Microbiol Infect Dis．1999，22(1):41－61．

［18］ 高正琴，張強(qiáng)，賀爭(zhēng)鳴，等．肝螺桿菌多重PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用［J］．人獸共患病學(xué)報(bào)，2008，24(10):891－895．

［19］ 李晨，王秀華，黃倢．三種主要水產(chǎn)病原菌多重PCR檢測(cè)方法的建立［J］．漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展，2010，31(6):100－106．

［20］ 馬保臣，秦卓明，蔡玉梅，等．多重PCR檢測(cè)奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌、停鏈球菌和酵母菌方法的建立與應(yīng)用［J］．畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006，37(11):1202－1208．