• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    棉葉中棉酚的快速提取與測定方法研究

    2012-11-24 06:59:24景偉文遆曉南陳燕勤張坤馳
    關(guān)鍵詞:棉葉棉酚萜烯

    景偉文,遆曉南,陳燕勤,張坤馳,劉 喜

    新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院化學(xué)生物學(xué)研究室,烏魯木齊830052

    棉葉中棉酚的快速提取與測定方法研究

    景偉文,遆曉南*,陳燕勤,張坤馳,劉 喜

    新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院化學(xué)生物學(xué)研究室,烏魯木齊830052

    棉酚(G)及其相關(guān)物甲氧基半棉酚(DHG)、半棉酚酮(HGQ)、半棉酚(HG)、殺實(shí)夜蛾素(H1-4)等是棉花中重要的抗蟲性萜烯類次生物質(zhì)。利用高效液相色譜法(HPLC)對棉酚及其相關(guān)物進(jìn)行了分離,測定了棉葉中的棉酚含量,討論了不同的提取方法和測定條件對結(jié)果的影響,給出了一套簡便、快速的分析測試方法,同時與紫外-可見分光光度法(苯胺法)的結(jié)果進(jìn)行了對比,認(rèn)為對于棉花的抗蟲性的研究來說,HPLC是比較適宜的方法。

    棉酚;HPLC;苯胺比色法

    萜烯類物質(zhì)是棉葉中最重要的抗蟲性次生物質(zhì)之一,這些物質(zhì)包括棉酚(G)及其相關(guān)物甲氧基半棉酚(DHG)、半棉酚酮(HGQ)、半棉酚(HG)、殺實(shí)夜蛾素(H1-4)等[1]。研究表明,棉葉色素腺體內(nèi)的棉酚等次生物質(zhì)對棉花害蟲如棉鈴蟲的生長發(fā)育具有明顯的抑制作用,當(dāng)棉酚含量達(dá)到一定值時,蟲體內(nèi)的解毒活力就會受到抑制,昆蟲幼蟲的正常生長受到影響最終導(dǎo)致幼蟲死亡[2-5]。因此,為了解棉花品種的抗蟲性,探明萜烯類物質(zhì)在棉株體內(nèi)的含量分布情況,尤其是在棉葉中積累的時間變化特性,必須建立一種有效的分析測試方法。

    關(guān)于棉酚測定的方法很多,最為常用的是紫外-可見分光光度法和色譜法[6-9]。目前文獻(xiàn)中介紹的液相色譜分析方法,有的如國標(biāo)法,適合于植物油或以棉籽餅為原料的食品中游離棉酚的測定[10,11];有的如張永軍等將植物樣品加提取液振蕩2小時后離心,減壓濃縮氮?dú)獯蹈啥ㄈ葸^濾后進(jìn)行測定,方法可以對多組分同時定量但樣品的處理稍嫌繁瑣費(fèi)時[12]。本文著重對棉葉樣品的提取進(jìn)行了討論,篩選出一種便捷、易行的前處理方法,同時利用HPLC法對棉葉中各種萜烯類物質(zhì)進(jìn)行分離,測定了棉酚物質(zhì)的含量,并將其結(jié)果與紫外-可見分光光度法(苯胺法)比較,為分析方法的選擇提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料

    供試棉花為盆栽棉花(新陸早17),常規(guī)管理,生長期不使用任何農(nóng)藥。

    棉葉樣品采集后去除水分,磨碎過篩(40目)備用。

    1.2 儀器與試劑

    島津LC-20AB型高效液相色譜儀,SPD-M20A檢測器,色譜柱:C18柱(5 μm,4.6×150 mm),普析通用TU-1810型紫外可見分光光度計,超聲清洗器,振蕩器,離心機(jī),粉碎機(jī)。

    圖1 棉株中的萜烯類物質(zhì)[1]Fig.1 Terpenoids in cotton[1]

    棉酚標(biāo)準(zhǔn)樣品:購自 Sigma公司(批號106K4013,95%以上)。稱取純棉酚0.0117 g,以提取溶劑溶解、定容至100 mL容量瓶中,得到濃度為117.0 mg/L的儲備液。再以提取溶劑將儲備液稀釋成濃度為35.1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液。分別取此工作液2、4、6、8、10 mL稀釋至25 mL容量瓶中,得到濃度分別為2.8、5.6、8.4、11.2、14.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。其余所用甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、乙酸、NN二甲基甲替酰胺、磷酸、正己烷、丙酮、四氫呋喃等均為色譜純試劑(上海星可生化有限公司)。

    1.3 樣品的處理

    1.3.1 HPLC法

    稱取粉碎樣品0.1 g左右(精確至0.0001 g)于具塞離心管中,加入提取溶劑超聲-振蕩提取后離心,取上清液過濾后進(jìn)行測定。

    表1 樣品不同除水處理方式的影響Table 1 The result of different dehydrated cotton samples

    1.3.1.1 樣品不同除水處理方式的影響

    分別采用以下幾種方式對樣品進(jìn)行除水處理,所測結(jié)果如表1。

    測定結(jié)果表明,真空冷凍干燥處理的樣品測定所得色譜峰面積最大。真空冷凍干燥法水分去除徹底,且低溫不破壞組分,所測結(jié)果應(yīng)該最為可靠,但是儀器設(shè)備投資比較大。低溫烘干法的結(jié)果與真空干燥法相近,且簡單易行,故應(yīng)用廣泛。

    1.3.1.2 提取過程的影響

    1.3.1.2.1 提取溶劑的確定

    常溫下,純棉酚呈黃色晶體,易溶于乙醇、乙醚、丙酮和三氯甲烷等有機(jī)溶劑,不溶于水、己烷及低沸點(diǎn)的石油醚。故此,在分析檢測棉酚的過程中,常用這些有機(jī)溶劑來提取或分離棉酚。不同的提取溶劑由于極性的不同導(dǎo)致提取結(jié)果的不同。分別以乙腈+水+磷酸、無水乙醇、乙酸乙酯∶正己烷(1∶3)、70%丙酮、四氫呋喃為提取溶劑進(jìn)行提取后進(jìn)行測定,所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,以乙腈+水+磷酸為提取劑時所得色譜峰峰形最佳,面積最大。另外,棉酚在乙腈中的穩(wěn)定性也比較好,且該提取溶劑與流動相互溶性好,最終確定為合適的提取液。

    1.3.1.2.2 提取方式的選擇

    比較了常用的冷浸過夜、振蕩和超聲等提取方式的異同,結(jié)果顯示,以振蕩15 min+超聲15 min的提取方式效果較好。

    1.3.1.2.3 提取液的處理

    采用兩種方式對提取液進(jìn)行處理:a.提取液離心分離出上清液,氮?dú)獯蹈?,? mL提取溶劑沖洗定容后測定;b.提取液離心分離后直接進(jìn)行測定。試驗(yàn)結(jié)果表明,b的結(jié)果高于a。前處理的步驟,如樣品轉(zhuǎn)移、沖洗等會導(dǎo)致樣品當(dāng)中棉酚含量的損失,因此采取提取后直接測定的方法比較簡便、適宜。

    1.3.2 紫外可見分光光度計法(Smith-苯胺法)

    稱取粉碎樣品0.1 g左右(精確至0.0001 g)置于250 mL帶塞三角瓶中,加20 mL玻璃珠(6 mm),再加3 mL抗壞血酸溶液(3 g抗壞血酸溶于45 mL溶液A及0.5 mL濃鹽酸,混勻;溶液A:715 mL乙醇用水稀釋至1000 mL,加冰醋酸0.2 mL及200 mL乙醚)振搖,3 min后葉綠素褪色,加提取溶劑超聲-振蕩提取,減壓抽濾,漏斗及濾紙用少量的溶劑沖洗。濾液置于50 mL容量瓶中,用提取溶劑稀釋至刻度,取此液5 mL(雙份,分別記為a、b),置于25 mL容量瓶中,同時取提取溶劑5mL(雙份,分別記為a0、b0)置于25 mL容量瓶中,向b、b0中加入0.5 mL新蒸苯胺,置于75℃水浴加熱40 min,冷卻后與a、b一起以提取溶劑稀釋至刻度,測定吸光度[13]。

    1.4 測定條件

    1.4.1 HPLC法

    流動相:乙醇/甲醇/異丙醇/乙腈/水/乙酸乙酯/N,N-二甲基甲替酰胺/磷酸(V/V=16.7/4.6/ 12.1/20.2/37.4/3.8/5.1/0.1),等度洗脫;流速:1.0 mL·min-1;檢測波長:272 nm;柱溫:55℃;進(jìn)樣量20 μL。

    1.4.2 紫外可見分光光度計法(Smith-苯胺法)

    以a0為參比測定空白測定液b0的吸光度A0,以a為參比測定試樣測定液b的吸光度A,A-A0為校正的試樣溶液吸光度值。測定波長445 nm。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 HPLC法

    2.1.1 流動相的選擇

    對于棉酚的分析測定,文獻(xiàn)上多采用甲醇-水或四氫呋喃+水作為流動相,但是棉酚在四氫呋喃或甲醇組成的溶劑中并不穩(wěn)定,隨放置時間的延長,雜質(zhì)峰逐次增大,主峰逐次減小。同時,這些簡單的流動相只能分離出棉酚組分,不能同時分離出HG、HGQ和H1-4這些結(jié)構(gòu)上與棉酚非常相近的萜烯類次生物質(zhì),因而難以同時對這些物質(zhì)進(jìn)行測定。經(jīng)嘗試,采用甲醇/乙醇/異丙醇/乙腈/水/乙酸/N-N二甲基甲替酰胺/磷酸(16.7/4.6/12.1/20.2/37.4/ 3.8/5.1/0.1)作為復(fù)合流動相,可以對棉花中的多種萜烯類化合物進(jìn)行高效分離,達(dá)到測定目的。棉酚的紫外吸收峰有多個,包括254 nm、272 nm等,其中在272 nm處的吸收峰干擾少,靈敏度高,故選擇272 nm處為測定波長。

    在以上確定的提取與測定條件下,所得譜圖(見圖 2)與文獻(xiàn)中的譜圖相比,確定組分峰名[1,12,14]。

    圖2 樣品的HPLC色譜圖Fig.2 The HPLC chromatograph of terpenoids in cotton samples

    2.1.2 樣品預(yù)處理

    提取溶劑的選擇要保證既能得到較高的提取率,同時又要考慮到樣品中基體物質(zhì)的干擾。另外,進(jìn)行HPLC測定時還需考慮要與流動相相容。綜合以上因素,選擇乙腈+水+磷酸為提取劑。由于棉酚為一多羥基酚化合物,遇光、熱易氧化變質(zhì),故多采用冷浸或超聲提取的方式,否則會造成棉酚的損失。相比于冷浸法,超聲提取由于其固有的空化作用,效率較高。結(jié)合常溫振蕩方式機(jī)械破壞植物細(xì)胞結(jié)構(gòu),有助于提取充分。棉酚結(jié)構(gòu)式中含有醛基和羥基,化學(xué)性質(zhì)很活潑,極易被氧化而變質(zhì),因此提取時間不宜過長。由于超聲提取效率較高,亦可相應(yīng)縮短提取時間。

    2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和靈敏度

    利用外標(biāo)法定量。將配制好的棉酚標(biāo)準(zhǔn)溶液(2.8、5.6、8.4、11.2、14.0 mg/L)進(jìn)行測定,以棉酚標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度x(mg/L)為橫坐標(biāo),峰面積y為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為y=50835x-16681,R2=0.9999,由此表明棉酚在上述質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好。棉酚的最低檢出限為8.5 ng(按20 μL計)。

    2.1.4 平行性與重復(fù)性測定

    稱取六份樣品各0.1 g左右,低溫烘干后過40目篩,以乙腈+水+磷酸為提取劑,振蕩15 min+超聲15 min提取,離心分離后測定棉酚的含量,所得數(shù)據(jù)如表2。

    表2 棉酚HPLC法平行性的測定Table 2 The reproducibility of gossypol in samples for HPLC

    2.1.5 加標(biāo)回收率測定

    稱取樣品按上述確定的條件(2.1.4)進(jìn)行提取和測定,在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣液中棉酚的濃度;再次在提取液中分別加入棉酚標(biāo)液(2.8 mg/L、8.4 mg/ L、14.0 mg/L)各1.0 mL進(jìn)行測定,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得加標(biāo)后濃度,按下式計算回收率[15],所得回收率為86.4%~93.4%(見表3)。

    加標(biāo)回收率(%)=(樣液加標(biāo)后物質(zhì)的量-樣液中物質(zhì)的量)/標(biāo)液中物質(zhì)的量×100%

    表3 棉酚回收率的測定(HPLC)Table 3 Recovery determination for gossypol(HPLC)

    2.2 紫外-可見分光光度法

    選擇不同的提取溶劑(70%丙酮、無水乙醇、乙醚、溶劑A)按照上述方法(1.3及1.4)進(jìn)行提取和測定。結(jié)果表明,以溶劑A作提取劑時所得吸光度值為最大。因此,以溶劑A作提取劑,振蕩15 min +超聲15 min提取后測定樣品中棉酚的含量,所得結(jié)果見表4。

    表4 紫外-可見分光光度法平行性的測定Table 4 The reproducibility of samples for UV spectrum

    3 樣品的測定

    采用上述HPLC法對一定生長時期的棉花葉片樣品中的棉酚含量進(jìn)行了測定,所得結(jié)果如圖3。結(jié)果顯示,在棉花生長過程中,棉酚含量表現(xiàn)出一定程度的起伏,表明在棉株不同的發(fā)育時期棉葉內(nèi)次生物質(zhì)棉酚的含量有所不同。

    圖3 棉葉中棉酚的動態(tài)變化Fig.3 The dynamic variations of gossypol in cotton leaves

    4 討論

    目前,分光光度法在國內(nèi)外應(yīng)用較普遍。Smith-苯胺法利用棉酚中含有的芳香醛結(jié)構(gòu)與苯胺反應(yīng)形成黃色物質(zhì)進(jìn)行比色測定,棉株中所有的含芳香醛基的物質(zhì)均可與苯胺發(fā)生此反應(yīng),因此測得的實(shí)際是樣品提取液中萜烯類物質(zhì)的總和,還包括棉酚的磷脂衍生物和親水棉酚衍生物等在一定波長下吸光度的總和,對棉酚不具有專一性,因此使得結(jié)果偏高。經(jīng)F統(tǒng)計檢驗(yàn),HPLC法所測結(jié)果與Smith-苯胺法比色法所得結(jié)果存在顯著性差異。HPLC法是將棉酚與其他物質(zhì)分離后進(jìn)行測定的,因此,對于寄主植物的抗性研究來說,HPLC法應(yīng)該是比較可靠的方法。當(dāng)然,提取溶劑的不同對結(jié)果亦會產(chǎn)生一定的影響。

    長期以來,對棉葉中萜烯類物質(zhì)的測定工作主要集中在對棉酚的測定上。事實(shí)上,棉酚并不是棉葉中唯一的萜烯類次生物質(zhì)。因此,僅對棉酚含量進(jìn)行測定對于抗蟲性的研究來說是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。本文對以往測定棉酚的方法進(jìn)行了改進(jìn),建立的前處理及HPLC法簡便、快捷而準(zhǔn)確。同時,該方法能夠?qū)γ奕~中各個萜烯類次生物質(zhì)進(jìn)行分離,在此基礎(chǔ)上,才能實(shí)現(xiàn)對各個萜烯類物質(zhì)的含量測定。這對于進(jìn)一步弄清萜烯類物質(zhì)與棉花抗蟲性之間的關(guān)系,以便達(dá)到更好地抗性調(diào)節(jié)的目的是非常有益的工作,亦是作者今后努力的方向。

    1 Stipanovic RD,Altman DW,Begin DL,et al.Terpenoid Aldehydes in upland cottons:analysis by aniline and HPLC methods.J Agric Food Chem,1988,36:509-515.

    2 Wang CZ(王琛柱).Effects of gossypol and tannic acid on the growth and digestion physiology of cotton bollworm larvae.Acta Phytophyl Sin(植物保護(hù)學(xué)報),1997,24:10-18.

    3 Fei Y(費(fèi)躍),Guo CZ(郭長佐),Huang ZY(黃志勇),et al.Effects of gossypol on the growth of cotton bollworm.China Cotton(中國棉花),1997,24(4):21.

    4 Hedin PA,Parrott WL,Jenkins JN.Relationships of glands,cotton square terpenoid aldehydes and other allelochemicals to larval growth of Heliothis virescens(Lepidoptera:Noctuidae).J Econ Entomol,1992,85:359-364.

    5 Ti XN,Zhang KC.Advances in research of induced resistance to insects in cotton.Front Biol China,2009,3:1673-3622.

    6 Huang TB(黃天寶),Wang LR(王立人),Liu GL(劉桂蘭),et al.Determination of residual gossypol in cotton seed cake by reversed-phase HPLC.Chin J Anal Chem(分析化學(xué)),1989,1:1025-1027.

    7 Lu DQ(盧定強(qiáng)),Duan L(段柳),Wu YS(吳雅霜),et al.RP-HPLC determination of gossypol acetate.Chin J Pharm Anal(藥物分析雜志),2008,28:1562-1564.

    8 Ao WP(敖維平),Qu MY(曲明悅).Election appropriate conditions of rapid measurement for free gossypol.J Anim Sci Vet Med(畜牧獸醫(yī)雜志),2007,6(26):23-25.

    9 Wen H(文虹).Determination of the content of free gossypol by reversed-phase HPLC.Jiangxi Feed(江西飼料),1999,6:21-22.

    10 GB/T 17334—1998(國標(biāo)法),Determination of free gossypol in foodstuff(食品中游離棉酚的測定).

    11 GB/T 5009.148—2003(國標(biāo)法),Determination of free gossypol in phytogenic foodstuff(植物性食品中游離棉酚的測定).

    12 Zhang YJ(張永軍),Wang WG(王武剛),Guo YY(郭予元).Analysis of terpenoids and their spatio-temporal expression of content in Bt transgenic cotton by HPLC method.Chin J Appl Environ Biol(應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報),2001,7:37-40.

    13 GB/T 5009.37—2003(國標(biāo)法),Method for analysis of hygienic standard of edible oils(食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法).

    14 Altman DW,Stipanovic RD,Benedict JH.Terpenoid aldehydes in upland cottons.П.Genotypes-environment interactions.Crop Sci,1989,29:1451-1456.

    15 Wu SH(吳樹宏),Zhou CH(周春華).Discussion on calculation of recovery.GANSU Environ Study Monit(甘肅環(huán)境研究與監(jiān)測),2000,13:179-180.

    Quick Extraction and Analysis of Gossypol in Cotton Leaves

    JING Wei-wen,TI Xiao-nan*,CHEN Yan-qin,ZHANG Kun-chi,LIU Xi
    The Laboratory of Chemical Biology,Department of Chemical Engineering,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China

    The terpenoids in cotton contain a unique group of secondary metabolites,which include desoxyhemigossypol (DHG),hemigossypolone(HGQ),hemigossypol(HG),gossypol(G),and heliocides H1,H2,H3and H4(H1-4).These compounds have been shown to be important in protecting the plant from cotton insects.An HPLC method has been utilized for separating individual terpenoid and quantitating gossypol in cotton leaves.Some influencing factors,such as extracting and pre-treating process,were discussed and a set of simple,rapid method was developed.At the same time,the result of the UV-visible spectrophotometry(aniline method)was described and compared.The results showed that HPLC analysis was more reasonable for the insect-resistance investigation in cotton.

    gossypol;aniline method;HPLC

    1001-6880(2012)04-0498-05

    2010-09-07 接受日期:2011-03-17

    國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30760135)

    *通訊作者 Tel:86-991-8762831;E-mail:tixiaonan@163.com

    R284.2

    A

    猜你喜歡
    棉葉棉酚萜烯
    4-萜烯醇對沙門菌的抗菌機(jī)制
    漫步在森林當(dāng)中為何讓人感覺心情舒暢?
    醋酸棉酚對人舌鱗癌Cal-27細(xì)胞侵襲性作用的實(shí)驗(yàn)研究
    輻射松與杉木在高溫干燥中萜烯類釋放濃度研究*
    醋酸棉酚旋光異構(gòu)體的制備及其含量測定研究
    不同棉花品種棉葉螨的發(fā)生動態(tài)
    棉葉螨無公害防治技術(shù)
    一種改性萜烯酚樹脂及其制備方法及其在輪胎胎面膠中的應(yīng)用
    飼糧游離棉酚水平對蛋雞肝臟棉酚蓄積及生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)的影響
    棉葉螨的研究及防治
    亚洲精品久久久久久婷婷小说| 午夜激情av网站| 久久ye,这里只有精品| svipshipincom国产片| 欧美大码av| 成人影院久久| 黄色怎么调成土黄色| 国产成人av激情在线播放| 黄片播放在线免费| 久久 成人 亚洲| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 欧美日韩av久久| 狂野欧美激情性bbbbbb| 热re99久久精品国产66热6| 999久久久国产精品视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| 欧美在线黄色| 午夜福利一区二区在线看| 少妇被粗大的猛进出69影院| 91麻豆精品激情在线观看国产 | a级毛片在线看网站| 桃红色精品国产亚洲av| 免费观看a级毛片全部| 成人国产av品久久久| 女性生殖器流出的白浆| 91av网站免费观看| 久久精品国产亚洲av高清一级| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国产又色又爽无遮挡免| av视频免费观看在线观看| av视频免费观看在线观看| 亚洲男人天堂网一区| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 妹子高潮喷水视频| 黄色 视频免费看| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 久久久久久人人人人人| 久久久久久久大尺度免费视频| 不卡一级毛片| 国产高清视频在线播放一区 | 最近最新免费中文字幕在线| 伊人亚洲综合成人网| 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲一区二区三区欧美精品| 国产精品 国内视频| 99国产精品一区二区蜜桃av | 黄频高清免费视频| 亚洲视频免费观看视频| 1024香蕉在线观看| 欧美黄色片欧美黄色片| 99re6热这里在线精品视频| 国产一区二区激情短视频 | 久久热在线av| 精品第一国产精品| 我的亚洲天堂| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 亚洲 欧美一区二区三区| 高清欧美精品videossex| 国产精品一二三区在线看| 精品亚洲成a人片在线观看| 人妻 亚洲 视频| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国产精品九九99| 久久久久久久久久久久大奶| 精品熟女少妇八av免费久了| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 婷婷丁香在线五月| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 丰满少妇做爰视频| av免费在线观看网站| 999久久久国产精品视频| 欧美97在线视频| 在线精品无人区一区二区三| 永久免费av网站大全| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 精品亚洲成a人片在线观看| 黄片小视频在线播放| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 国产精品成人在线| 69精品国产乱码久久久| 各种免费的搞黄视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 中文字幕av电影在线播放| 国产精品久久久久久精品电影小说| 国产成人欧美| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 国产成人精品久久二区二区91| 久9热在线精品视频| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 9色porny在线观看| 欧美乱码精品一区二区三区| 一级黄色大片毛片| 精品人妻1区二区| 久热这里只有精品99| 女性生殖器流出的白浆| 电影成人av| 亚洲国产av影院在线观看| 日本vs欧美在线观看视频| 一区二区av电影网| 两人在一起打扑克的视频| 最新在线观看一区二区三区| 黄色a级毛片大全视频| av不卡在线播放| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产欧美日韩一区二区三 | 中文字幕人妻熟女乱码| 青春草亚洲视频在线观看| 欧美性长视频在线观看| 不卡一级毛片| 人妻 亚洲 视频| 满18在线观看网站| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 国产精品二区激情视频| 一级,二级,三级黄色视频| 精品久久蜜臀av无| 午夜福利影视在线免费观看| 免费在线观看影片大全网站| 久久久精品免费免费高清| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 超色免费av| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国产亚洲精品一区二区www | 91老司机精品| 老司机在亚洲福利影院| 欧美av亚洲av综合av国产av| 久久久国产精品麻豆| 欧美日韩视频精品一区| 国产97色在线日韩免费| 国产亚洲欧美精品永久| 国产99久久九九免费精品| 水蜜桃什么品种好| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 一个人免费在线观看的高清视频 | 精品卡一卡二卡四卡免费| 妹子高潮喷水视频| 1024香蕉在线观看| 成人亚洲精品一区在线观看| 69精品国产乱码久久久| 精品第一国产精品| 久久久精品区二区三区| 免费黄频网站在线观看国产| 人成视频在线观看免费观看| 99热网站在线观看| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 99精国产麻豆久久婷婷| 国产成人影院久久av| 国产成人av教育| 天堂8中文在线网| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产一区有黄有色的免费视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 69精品国产乱码久久久| 久久ye,这里只有精品| 一本大道久久a久久精品| 日本五十路高清| 成人亚洲精品一区在线观看| 波多野结衣一区麻豆| 国产人伦9x9x在线观看| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| videos熟女内射| 90打野战视频偷拍视频| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲情色 制服丝袜| 岛国在线观看网站| 日本五十路高清| 91成年电影在线观看| 国产av又大| 91大片在线观看| 手机成人av网站| 欧美亚洲日本最大视频资源| 啦啦啦在线免费观看视频4| 欧美日韩黄片免| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产黄色免费在线视频| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产1区2区3区精品| 亚洲精品在线美女| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 久久久久久久久久久久大奶| 国产亚洲欧美精品永久| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 丝袜美腿诱惑在线| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 一本大道久久a久久精品| 国产在线观看jvid| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 国产色视频综合| 9色porny在线观看| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 午夜免费成人在线视频| 老汉色av国产亚洲站长工具| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 国产激情久久老熟女| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲av电影在线进入| 99热国产这里只有精品6| 热re99久久国产66热| 亚洲 国产 在线| 女人久久www免费人成看片| 中文字幕人妻熟女乱码| 久久 成人 亚洲| 中文字幕制服av| 999久久久国产精品视频| 午夜福利影视在线免费观看| 999久久久国产精品视频| videosex国产| 欧美成狂野欧美在线观看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 在线观看舔阴道视频| 国产成人av教育| 制服人妻中文乱码| 国产精品久久久久成人av| www.自偷自拍.com| 久久久水蜜桃国产精品网| 国产精品偷伦视频观看了| 欧美久久黑人一区二区| 性色av一级| 他把我摸到了高潮在线观看 | 男女床上黄色一级片免费看| 十八禁人妻一区二区| 久久影院123| 国产精品国产三级国产专区5o| 国产精品国产av在线观看| 老鸭窝网址在线观看| 在线av久久热| 高清欧美精品videossex| 午夜影院在线不卡| 久久99一区二区三区| 亚洲精品国产色婷婷电影| 日韩一区二区三区影片| 国产主播在线观看一区二区| 欧美精品一区二区大全| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 日韩 亚洲 欧美在线| 欧美激情 高清一区二区三区| 最黄视频免费看| 精品卡一卡二卡四卡免费| av天堂在线播放| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 我要看黄色一级片免费的| 无遮挡黄片免费观看| 久久99一区二区三区| 制服人妻中文乱码| 悠悠久久av| 亚洲av电影在线进入| 女人精品久久久久毛片| 老司机深夜福利视频在线观看 | 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产精品久久久人人做人人爽| 亚洲人成电影观看| 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲精品中文字幕在线视频| 一二三四社区在线视频社区8| 国产精品偷伦视频观看了| 人人澡人人妻人| 不卡一级毛片| 国产一区二区激情短视频 | 国产欧美日韩一区二区三区在线| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 女人精品久久久久毛片| 久久久久网色| 国产又色又爽无遮挡免| 国产黄频视频在线观看| 精品一区二区三区av网在线观看 | 2018国产大陆天天弄谢| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 在线观看免费日韩欧美大片| 精品国产乱子伦一区二区三区 | 91国产中文字幕| 久久国产亚洲av麻豆专区| 嫩草影视91久久| 国产精品av久久久久免费| 少妇的丰满在线观看| 下体分泌物呈黄色| 他把我摸到了高潮在线观看 | 欧美日韩福利视频一区二区| 亚洲中文日韩欧美视频| 91成人精品电影| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 啦啦啦在线免费观看视频4| 乱人伦中国视频| 天堂中文最新版在线下载| www.精华液| 在线观看www视频免费| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 99久久精品国产亚洲精品| 老司机在亚洲福利影院| kizo精华| bbb黄色大片| 五月天丁香电影| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲人成电影免费在线| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 少妇被粗大的猛进出69影院| 免费观看a级毛片全部| 热re99久久国产66热| 精品视频人人做人人爽| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 我要看黄色一级片免费的| 久久av网站| 少妇人妻久久综合中文| 成年人午夜在线观看视频| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产极品粉嫩免费观看在线| 成年人午夜在线观看视频| 高清视频免费观看一区二区| 国产一区二区在线观看av| www日本在线高清视频| avwww免费| 女警被强在线播放| 国产精品久久久久成人av| 久久毛片免费看一区二区三区| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 国产在视频线精品| 国产av一区二区精品久久| 国产黄频视频在线观看| 精品高清国产在线一区| 日韩精品免费视频一区二区三区| 桃红色精品国产亚洲av| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 搡老岳熟女国产| 国产色视频综合| 在线观看舔阴道视频| 精品人妻在线不人妻| 免费在线观看黄色视频的| 欧美人与性动交α欧美软件| 在线永久观看黄色视频| 亚洲人成电影免费在线| 老司机深夜福利视频在线观看 | 亚洲精品国产色婷婷电影| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 最近最新免费中文字幕在线| 国产99久久九九免费精品| 91成人精品电影| 国产三级黄色录像| 国产男人的电影天堂91| 国产精品国产三级国产专区5o| 国产精品九九99| 夫妻午夜视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 色视频在线一区二区三区| 在线观看一区二区三区激情| 久久精品亚洲av国产电影网| 国产精品久久久久成人av| 99精品欧美一区二区三区四区| 日韩大片免费观看网站| 亚洲熟女毛片儿| 国产精品av久久久久免费| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 欧美在线一区亚洲| 高潮久久久久久久久久久不卡| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产黄频视频在线观看| 午夜91福利影院| 1024香蕉在线观看| 十分钟在线观看高清视频www| 热re99久久精品国产66热6| 婷婷色av中文字幕| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 成人黄色视频免费在线看| 亚洲成人手机| 国产真人三级小视频在线观看| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 一区二区三区乱码不卡18| 国产在线免费精品| 人人澡人人妻人| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 亚洲精品国产av成人精品| 久久中文看片网| 国产成人免费观看mmmm| 一区二区三区激情视频| 蜜桃在线观看..| www.精华液| 午夜影院在线不卡| 最黄视频免费看| 亚洲一区中文字幕在线| 午夜福利在线免费观看网站| www.精华液| 日韩欧美国产一区二区入口| 中国美女看黄片| 美女国产高潮福利片在线看| 日本五十路高清| 久久免费观看电影| 在线观看舔阴道视频| 十八禁网站网址无遮挡| 国产亚洲欧美精品永久| 午夜视频精品福利| 一级片免费观看大全| 日韩免费高清中文字幕av| 久久久久精品人妻al黑| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 免费黄频网站在线观看国产| 国产一区二区三区av在线| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 岛国毛片在线播放| 中文字幕最新亚洲高清| 欧美97在线视频| 亚洲伊人久久精品综合| 另类精品久久| 亚洲av日韩在线播放| 国产成人免费无遮挡视频| 国产精品国产av在线观看| 亚洲综合色网址| 亚洲少妇的诱惑av| 免费观看a级毛片全部| 国产亚洲av高清不卡| 一级,二级,三级黄色视频| 超碰成人久久| 亚洲av电影在线进入| 午夜免费鲁丝| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 三级毛片av免费| 少妇粗大呻吟视频| 色精品久久人妻99蜜桃| 无限看片的www在线观看| 在线天堂中文资源库| 国产精品 欧美亚洲| 97在线人人人人妻| 精品国产乱码久久久久久小说| 美女扒开内裤让男人捅视频| 欧美 日韩 精品 国产| 电影成人av| 无限看片的www在线观看| 日本黄色日本黄色录像| 欧美国产精品一级二级三级| 精品人妻一区二区三区麻豆| 久久九九热精品免费| 国产精品99久久99久久久不卡| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 精品高清国产在线一区| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 精品一品国产午夜福利视频| 99热网站在线观看| 999久久久国产精品视频| 欧美精品一区二区免费开放| 久久久久网色| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 亚洲视频免费观看视频| 成年女人毛片免费观看观看9 | 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 9色porny在线观看| 精品国产一区二区三区四区第35| 欧美久久黑人一区二区| 新久久久久国产一级毛片| 两性夫妻黄色片| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 国产一区二区三区综合在线观看| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产又爽黄色视频| 精品久久久久久电影网| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 香蕉丝袜av| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 久久av网站| 国产精品一区二区在线不卡| 精品视频人人做人人爽| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 男人操女人黄网站| 国产精品一二三区在线看| 免费看十八禁软件| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 亚洲熟女精品中文字幕| 手机成人av网站| 欧美在线一区亚洲| 曰老女人黄片| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 老司机午夜十八禁免费视频| 成年av动漫网址| 欧美日韩一级在线毛片| 欧美亚洲日本最大视频资源| 后天国语完整版免费观看| 午夜两性在线视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 又紧又爽又黄一区二区| 最近最新免费中文字幕在线| 亚洲专区国产一区二区| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 老熟妇乱子伦视频在线观看 | 亚洲七黄色美女视频| 窝窝影院91人妻| 国产欧美亚洲国产| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲精品美女久久av网站| 国产一区二区 视频在线| 他把我摸到了高潮在线观看 | 啦啦啦中文免费视频观看日本| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 91大片在线观看| av视频免费观看在线观看| 多毛熟女@视频| 欧美黑人精品巨大| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 少妇人妻久久综合中文| 亚洲全国av大片| 极品人妻少妇av视频| 午夜免费成人在线视频| 女警被强在线播放| 久久久久久久大尺度免费视频| 国产色视频综合| 国产精品久久久久久精品古装| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲av日韩在线播放| 老司机影院成人| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 水蜜桃什么品种好| 天天操日日干夜夜撸| 国产精品久久久久久精品电影小说| av网站免费在线观看视频| 色老头精品视频在线观看| 男女下面插进去视频免费观看| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 亚洲七黄色美女视频| 曰老女人黄片| 最近最新免费中文字幕在线| 亚洲精品第二区| 免费高清在线观看视频在线观看| 一区二区三区激情视频| 丝袜人妻中文字幕| 麻豆乱淫一区二区| 十八禁人妻一区二区| 国产视频一区二区在线看| 黄片大片在线免费观看| 妹子高潮喷水视频| 久久香蕉激情| 18禁观看日本| 99久久国产精品久久久| 乱人伦中国视频| 国产97色在线日韩免费| 搡老岳熟女国产| 多毛熟女@视频| 亚洲精品一二三| 国产精品一区二区在线不卡| 亚洲精品一二三| 黄色a级毛片大全视频| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 黄色怎么调成土黄色| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 精品少妇内射三级| 亚洲九九香蕉| 岛国在线观看网站| 色精品久久人妻99蜜桃| 999久久久精品免费观看国产| 99热国产这里只有精品6| 91字幕亚洲| 国产97色在线日韩免费| 久久国产精品男人的天堂亚洲| www.精华液| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 真人做人爱边吃奶动态| 天天添夜夜摸| 9热在线视频观看99| 又大又爽又粗| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 日本vs欧美在线观看视频| 少妇精品久久久久久久| 午夜成年电影在线免费观看| 午夜福利,免费看| 久久 成人 亚洲| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 九色亚洲精品在线播放| 亚洲天堂av无毛| 男女午夜视频在线观看| 亚洲综合色网址| 国产一卡二卡三卡精品| av国产精品久久久久影院| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 色老头精品视频在线观看| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 不卡一级毛片| 免费不卡黄色视频| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 91大片在线观看| 国产精品九九99| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 51午夜福利影视在线观看| 在线观看舔阴道视频| 一个人免费在线观看的高清视频 | 妹子高潮喷水视频| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 老熟妇仑乱视频hdxx| 狂野欧美激情性xxxx| 久久久精品免费免费高清| 91老司机精品| 亚洲av电影在线进入| 精品少妇内射三级| 老司机在亚洲福利影院| 桃红色精品国产亚洲av| 嫩草影视91久久| 成人三级做爰电影| 午夜福利一区二区在线看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 免费观看人在逋| 亚洲精品第二区| 日本一区二区免费在线视频| 免费黄频网站在线观看国产| 人妻久久中文字幕网| 18禁国产床啪视频网站| 丁香六月欧美| 久久精品国产亚洲av高清一级| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 亚洲人成电影免费在线| 午夜影院在线不卡|