• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    豬骨膠原蛋白肽緩解高脂飲食誘導(dǎo)小鼠肝臟氧化應(yīng)激的基因芯片分析

    2012-11-24 06:59:30林云鑒樂國偉施用暉李亞欣
    關(guān)鍵詞:基因芯片節(jié)律高脂

    林云鑒,樂國偉*,施用暉,孫 進,李亞欣

    1江南大學(xué)食品學(xué)院食品營養(yǎng)與功能因子研究中心;2食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,無錫214122

    豬骨膠原蛋白肽緩解高脂飲食誘導(dǎo)小鼠肝臟氧化應(yīng)激的基因芯片分析

    林云鑒1,2,樂國偉1,2*,施用暉1,2,孫 進1,2,李亞欣1

    1江南大學(xué)食品學(xué)院食品營養(yǎng)與功能因子研究中心;2食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,無錫214122

    本研究探討豬骨膠原蛋白肽降血脂作用和抑制高脂飲食誘導(dǎo)肝臟抗氧化應(yīng)激的作用機理。40只小鼠分為5組,分別飼喂6 w正常日糧、高脂日糧、添加1.6%鈣的高脂日糧、添加1%膠原蛋白肽的高脂日糧和添加1.6%鈣+1%膠原蛋白肽的高脂日糧。研究發(fā)現(xiàn):與正常組相比,高脂日糧小鼠血脂和體重明顯升高。1.6%鈣處理可抑制體重過度升高,1%膠原蛋白肽和高鈣可協(xié)同抑制調(diào)節(jié)血脂,防止體重升高。高脂主要通過影響肝臟生理節(jié)律和過氧化物酶體增生物激活受體信號通路引起脂代謝異常,高鈣和骨膠原蛋白肽可顯著抑制肝臟氧化應(yīng)激,抑制生理節(jié)律紊亂。

    膠原蛋白肽;高脂日糧;基因芯片;氧化應(yīng)激

    長期高脂膳食會使肝臟攝取脂肪和貯存增多,引起細胞脂肪變性和血清游離脂肪酸(FFA)升高,肝臟β氧化作用加強,導(dǎo)致產(chǎn)生過多氧自由基(ROS),ROS攻擊生物大分子,最終導(dǎo)致諸如動脈粥樣硬化、糖尿病、炎癥、癌癥和衰老等疾病的發(fā)生[1]。

    蛋白質(zhì)和肽類抗氧化可清除體內(nèi)過量的自由基。膠原多肽是各種動物膠原蛋白(皮、骨、關(guān)節(jié)等)經(jīng)蛋白酶等降解后得到的相對分子量在20 kDa以下的產(chǎn)物,其消化吸收性不僅大大提高,同時還具有膠原蛋白的功能特性[2]。研究發(fā)現(xiàn),膠原多肽具有減緩動脈硬化、抗氧化、降血壓、改善骨質(zhì)疏松、促進皮膚膠原代謝等功能[3]。

    本研究用微波輔助水解法制備了豬骨膠原蛋白肽[4],并發(fā)現(xiàn)豬骨膠原蛋白肽具有抑制高脂引起小鼠肝臟氧化應(yīng)激的作用[5],高鈣日糧可與豬骨膠原蛋白肽協(xié)同發(fā)揮降血脂作用。本研究旨在探討其發(fā)揮抗氧化作用的機理。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    表1 日糧配方組成(%)Table 1 Composition of diet(%)

    1.2 動物實驗及肝臟樣品采集

    選用4周齡清潔級雄性KM種小鼠(上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供,生產(chǎn)許可證號碼:SCXK(滬)2007.0005),體重約18±2 g。正常日糧適應(yīng)1周后隨機分為5組,每組8只,依次為:①對照組(0.8%Ca,w/w)(Control);②高脂組(16.10%豬油,0.8%Ca,w/w)(High.fat diet,HF);③高脂高鈣組(16.10%豬油,1.6%Ca,w/w,HFHC);④高脂+1%骨膠原肽組(16.10%豬油+1%BCP);⑤高脂高鈣+1%骨膠原肽組(16.10%豬油+1.6%Ca+ 1%BCP);日糧配方見表1。小鼠同室分籠飼養(yǎng),溫度控制在23±2℃,濕度60%,自然光照,自由采食和飲水。

    每周稱重一次,飼喂6 W后每組取8只小鼠禁食12 h,摘眼球取血,2919×g離心10 min后分離血清,斷頸椎處死,迅速稱取肝臟用于基因表達譜分析。

    1.3 血脂水平測定

    用試劑盒測定血清中TC、HDL-C、LDL-C和總TG含量,具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。

    1.4 基因表達譜分析

    用RNeasy Mini Kit提取細胞總RNA,取10 μg,反轉(zhuǎn)錄為cDNA后利用Affymetrix GeneChip 3'擴增試劑進行擴增,用生物芯片高產(chǎn)量RNA轉(zhuǎn)錄子標(biāo)記試劑合成生物素標(biāo)記互補RNA(cRNA)。取10 μg,按照Affymetrix基因芯片表達分析技術(shù)手冊(http://www.affymetrix.com/upport/technical/manual/ expression.man ual.affx),在雜交爐中雜交到Affymetrix MOE430 2.0基因芯片。用基因芯片掃描儀讀取熒光信號信息?;蛐酒治霭凑誂ffymetrix基因芯片表達分析技術(shù)手冊進行。用 Microarray Suite 5.0進行信號強度平均化處理?;蚋淖冇胒old change(FC)表示。

    魚塘的建設(shè)和改造,不外乎以下幾個方面:小池改大池或大池改小池,淺塘改深塘,漏水塘改保水塘,死水塘改活水塘,低池埂改高池埂,但同時也要根據(jù)當(dāng)年所需要養(yǎng)殖的品種及養(yǎng)殖模式而確定改造建設(shè)的規(guī)劃與設(shè)計。

    1.5 數(shù)據(jù)分析

    利用Onto-Tools(http://vortex.cs.wayne.edu)在線分析工具中的pathway express分析顯著相關(guān)基因通路,顯著改變的基因通路用影響因子(IF)表示,IF值按以下公式計算:

    公式中Pi為測定的特定的通路,pi為得到一個統(tǒng)計數(shù)值的概率,Nde為偶然發(fā)生的幾率,PF為特定通路中所有基因的干擾因素,△E為用數(shù)學(xué)方法決定的標(biāo)記基因的標(biāo)準(zhǔn)測量表達改變。

    血脂及體重數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差,用SPSS軟件的單因素方差分析分析,用Tukey法進行多種比較。

    2 實驗結(jié)果

    2.1 小鼠體重和血脂

    試驗期間小鼠體重均有不同程度的增加。試驗?zāi)┢诟咧M小鼠增重顯著高于其他組(P<0.05) (表2)。從表3可以看出,高脂日糧處理小鼠血清TC、LDL-C和TG顯著升高(P<0.05),而HDL-C顯著降低。高鈣處理僅對高脂引起TC上升有抑制作用(P<0.05),但無法恢復(fù)正常水平。1%BCP處理和高鈣+1%BCP處理后,小鼠各項血脂與正常對照無顯著差異,具有顯著的降血脂作用。

    表2 試驗期間小鼠體重變化(g)Table 2 Weight gain of mice during experiment(g)

    表3 高鈣和骨膠原肽對小鼠血脂水平的影響Table 3 Effects of bone collagen peptides on lipid level in serum of mice(mmol/L)

    2.2 基因表達改變的總體分析

    根據(jù)Uunigen ID對MOE430 2.0基因芯片重復(fù)probe set進行剔除后,芯片共包含了45038條基因或SETs。從表4可以看出,BCP處理后誘導(dǎo)表達的上調(diào)基因高于高脂處理,而高脂處理誘導(dǎo)表達的下調(diào)基因高于BCP處理(表4)。

    表4 小鼠肝臟表達顯著改變的基因數(shù)目Table 4 Number of express changed genes

    2.3 肝臟顯著改變基因通路及相關(guān)基因

    Pathway express分析的結(jié)果表明,高脂處理后顯著改變的通路有5個(表5)。其中生理節(jié)律通路改變最為顯著,IF高達19。在堿基切除修復(fù)通路中,NEIL3顯著上調(diào),基因改變(FC)高達15.17。該基因主要負責(zé)切除氧化反應(yīng)產(chǎn)物氧化嘌呤如FapyG和FapyA。

    BCP+高脂處理后,小鼠肝臟有12個基因通路發(fā)生顯著改變,表5列出了相關(guān)性最強的7個通路。其中細胞粘著分子信號通路改變最為顯著(IF值高達401),該通路中有兩個基因表達被顯著抑制,包括內(nèi)皮或上皮細胞緊密連接基因claudin 1(Cldn1,-2.58)和神經(jīng)髓鞘蛋白零家族基因 1(Mpzl1,-2.52)。與高脂處理完全相反,BCP處理后,堿基切除修復(fù)通路中NEIL3的表達被極顯著抑制(-22.44)。BCP處理后,有5個重要的細胞周期調(diào)節(jié)基因表達發(fā)生顯著改變,其中G1期調(diào)控基因S期周期蛋白依賴激酶(Cip1,Cdkn1a,P21cip1)顯著下調(diào)(-3.83),G1/S期調(diào)控基因細胞周期蛋白E2(Ccne2,CCNE)表達顯著上調(diào)(2.57),G 2/M期過渡抑制因子wee1和Cdc14表達也顯著上調(diào)(4.91,2),同時,DNA損傷應(yīng)激基因Gadd45γ表達也顯著上調(diào)(3.16)。Ccne2、Cdkn1a和Gadd45 g三個基因也出現(xiàn)在P53基因通路,期表達模式可導(dǎo)致G1期阻滯。BCP處理誘導(dǎo)了Acot3、Acox1和Elovl6三個不飽和脂肪酸合成通路基因上調(diào),表達量分別為2.17、2.64和2.37。Wnt信號通路信號上游重要基因Wnt5b表達顯著上調(diào)(2.92),可能激活Wnt通路,阻遏成脂過程。

    表5 不同處理后小鼠肝臟顯著受影響的基因通路Table 5 Significantly changed gene pathways in liver

    過氧化物酶體增生物激活受體(PPAR)信號通路PPAR signaling pathway 11.001 4.06E-05 2.00E-04黑色素瘤Melanoma 7.499 0.01410325 0.004705堿基切除修復(fù)Base excision repair 7.423 0.087464771 0.005032脂肪組織細胞因子信號通路Adipocytokine signaling pathway 5.388 0.165249107 0.029200 HF+BCP處理細胞粘著分子Cell adhesion molecules(CAMs) 401.422 0.285373 1.86E-172生理節(jié)律Circadian rhythm 25.578 2.51E-08 2.07E-10堿基切除修復(fù)Base excision repair 9.031 0.216017 0.001200細胞周期Cell cycle 8.520 8.73E-04 0.001899不飽和脂肪酸合成Biosynthesis of unsaturated fatty acids 7.742 9.66E-04 0.003796 p53信號通路p53 signaling pathway 5.703 0.009671 0.022361過氧化物酶體增生物激活受體信號通路PPAR signaling pathway 5.166 0.014238 0.035192

    2.4 生理節(jié)律和PPAR信號通路的改變

    如圖1所示,高脂處理主要引起生理節(jié)律通路中節(jié)律基因Period2(Per2)基因表達下調(diào)(-2.14),該基因在此通路具有最重要的地位。BCP處理后節(jié)律基因Period2的表達抑制被逆轉(zhuǎn)(3.13),同時節(jié)律基因Period3表達被誘導(dǎo)(2.14),而核受體亞家族基因(Nr1d1或 Rev-erba)、晝夜節(jié)律鐘基因BMAL1(Arntl)和生物鐘基因Clock這三個生理節(jié)律關(guān)鍵功能基因的表達被顯著抑制,表達值分別為-2.3、-2.06和-2.09。

    如圖2所示,過氧化物酶體增生物激活受體信號通路中與脂肪代謝有關(guān)的細胞色素P450第7家族,alpha亞家族多肽表達顯著下調(diào)(-2.51)信號接受部位的脂肪酸結(jié)合蛋白(adipocyte,3.32和epidermal(aP2),2.29)顯著上調(diào),信號下游與脂肪細胞分化有關(guān)的脂肪細胞因子(adiponectin)顯著上調(diào)(2.69),該基因也是脂肪組織細胞因子信號通路唯一顯著改變的基因,是脂肪組織細胞因子信號通路的一個重要信號分子。膽固醇7α-羥化(Cyp7a1)表達顯著下調(diào)(-2.51)。adipocyte表達上調(diào),介導(dǎo)大量低密度脂蛋白進入肝細胞,通過構(gòu)成性表達PPARa下調(diào)CYP7A1,抑制膽固醇代謝。通過PPARg激活A(yù)p2和ADIPO表達,促進脂肪細胞分化,引起肝脂肪浸潤及脂肪肝。

    圖1 不同處理對生理節(jié)律通路基因表達的影響Fig.1 Express changed genes in circadian rhythm pathway

    圖2 不同處理對PPAR信號通路基因表達的影響Fig.2 Express changed genes in PPAR signaling pathway

    3 討論

    本研究顯示高鈣和骨膠原蛋白肽具有顯著的協(xié)同降血脂作用,這種作用主要通過調(diào)節(jié)肝臟基因表達實現(xiàn)。本研究中,高脂組小鼠血清低密度脂蛋白顯著升高,可能與高脂飼料對肝臟生理節(jié)律信號通路的調(diào)控有關(guān)。低密度脂蛋白的主要來源之一是肝合成后直接分泌到血液,說明,高脂處理加速肝臟低密度脂蛋白的合成。研究表明,生理節(jié)律蛋白BMAL1/CLOCK二聚體可通過多種途徑促進脂肪積累和脂肪細胞分化[6]。高脂飲食上調(diào)肝臟BMAL1/CLOCK抑制劑 Per的表達,可能釋放BMAL1/CLOCK,導(dǎo)致肝脂肪累積,并向血液運輸脂蛋白。本研究中,高脂處理后,肝臟過氧化物酶體增生物激活受體信號通路偏向于脂肪代謝抑制和脂肪細胞分化,也可證明以上推論。

    有研究表明,生理節(jié)律與過氧化物酶體增生物激活受體信號通路有直接的聯(lián)系[7],其主要鏈接點為PPARa。PPARa的激活受BMAL1/CLOCK二聚體的調(diào)控。本研究中,高脂日糧誘導(dǎo)了PPARa介導(dǎo)脂肪細胞分化的激活,這一過程可能應(yīng)該與生理節(jié)律通路的改變有關(guān)。

    此外,有研究顯示,高鈣膳食可抑制脂肪吸收[8],本研究中高鈣處理抑制高脂引起體增重增加可能與此有關(guān),但是高鈣對血脂沒有顯著的影響,說明高鈣僅僅抑制脂肪吸收,但無法抑制肝臟脂代謝紊亂。BCP和高鈣+BCP處理對體重和血脂都有顯著作用,說明BCP可能直接抑制肝臟氧化應(yīng)激并調(diào)節(jié)肝臟脂肪代謝。

    高脂處理引起NEIL3表達顯著上調(diào),而BCP處理后,NEIL3表達顯著下調(diào),說明,高脂處理誘導(dǎo)肝臟發(fā)生了明顯氧化應(yīng)激,BCP對此有顯著抑制作用。有研究證明在體內(nèi)羥脯氨酸游離的4-羥基能清除超氧自由基和羥基自由基,發(fā)揮抗氧化作用[9]。

    1 Li JX(李建喜),Yang ZQ(楊志強),Wang XZ(王學(xué)智).Biological function of reactive oxygen free radicals in animals.Prog Vet Med(動物醫(yī)學(xué)進展),2006,27:33-36.

    2 Xie J(謝靜),Wang CH(王傳花),Li Ke(李珂),et al.Preparation of collagen polypeptide from bone and study evolution of its functional property.Biotechnol Bull(生物技術(shù)通報),2008,3:13-16.

    3 Lin L(林琳).Studies on preparation of collagen and bioaetivities of collagen polypeptide from the skins of aquatic animals.Qingdao:Ocean University of China(中國海洋大學(xué)),PhD.2006.

    4 Wang JY(王潔昀),Li YX(李亞欣),Le GW(樂國偉),et al.Study on effect of microwave-acid treatment on enzymolysis of collagen.Technol Food Ind(食品工業(yè)科技),2010,31:97-100.

    5 Li YX(李亞欣),Le GW(樂國偉),Wang JY(王潔昀),et al.Effects of collagen peptides on antioxidant capacity and serum lipid metabolism of mice fed with high fat diet.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā)),2011,23:5 4-58,68.

    6 Hemmeryckx B,Himmelreich U,Hoylaerts MF,et al.Impact of cock gne bal1 deficiency on nutritionally induced obesity in mce.Obesity,2011,19:659-661.

    7 Froy O.The relationship between nutrition and circadian rhythms in mammals.Front Neuroedocrin,2007,28:61-71.

    8 Papakonstantinou E,F(xiàn)latt WP,Huth PJ,et al.High dietary calcium reduces body fat content,digestibility of fat,and serum vitamin D in rats.Obes Res,2003,11:387-394.

    9 Zuo RY(左瑞雅),Zhou XH(周小華),Du SY(杜首英).Coordination mechanism and antioxidantactivity ofL-hydroxyproline zinc(Ⅱ).Chin J Biotechnol(生物工程學(xué)報),2007,23:704-709.

    Inhibition of Liver Oxidative Stress by Pig Bone Collagen Peptide-a Microarray Study

    LIN Yun-jian1,2,LE Guo-wei1,2*,SHI Yong-hui1,2,SUN Jin1,2,LI Ya-xin11The Research Center of Food Nutrition and Functional Factors,School of Food Science and Technology,Jiangnan University;2The State Key Laboratory of Food Science and Technology Jiangnan University,Wuxi 214122,China

    This study was aimed to explore the effect of pig bone collagen peptide on high fat induced weight gain and blood lipid increase.Forty mice were divided into 5 groups,and administrated with normal diet,high fat diet,high fat diet containing 1.6%Ca,high fat diet containing 1%pig bone collagen peptide,and high fat diet containing high Ca and collagen peptide,respectively.The results showed that high Ca intake could prevent high fat induced weight gain.Pig bone collagen peptide could significantly prevent both increase in weight and blood lipid.Microarray analysis revealed that high fat induced molecular circadian rhythm disorder in liver which might be the reason for disorder of lipid metabolism.Bone collagen peptide prevented circadian rhythm disorder and oxidative stress.

    pig bone collagen peptide;high fat diet;DNA microarray;oxidative stress

    1001-6880(2012)04-0454-06

    2011-06-21 接受日期:2011-09-30

    國家863計劃(2007AA10Z325)

    *通訊作者 Tel:86-510-85917789;E-mail:lgw@jiangnan.edu.cn

    R151.2

    A

    猜你喜歡
    基因芯片節(jié)律高脂
    出生時即可預(yù)判發(fā)育潛力 基因芯片精準(zhǔn)篩選肉牛良種
    高脂血標(biāo)本對臨床檢驗項目的干擾及消除對策
    雙管單色熒光PCR法與基因芯片法檢測CYP2C19基因多態(tài)性的比較研究
    運動降低MG53表達及其在緩解高脂膳食大鼠IR中的作用
    蜆木扦插苗人工幼林生長節(jié)律
    應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測四種結(jié)核藥物敏感試驗的研究
    高脂飲食誘導(dǎo)大鼠生精功能障礙
    慢性給予GHRP-6對小鼠跑輪運動日節(jié)律的影響
    基于提升小波的基因芯片數(shù)據(jù)的分類預(yù)測
    味精與高脂日糧對生長豬胴體性狀與組成的影響
    欧美三级亚洲精品| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 欧美一区二区精品小视频在线| 又黄又粗又硬又大视频| 国产高清三级在线| 老司机福利观看| 日韩亚洲欧美综合| a级毛片a级免费在线| av天堂在线播放| 大型黄色视频在线免费观看| 手机成人av网站| 丁香六月欧美| 午夜精品一区二区三区免费看| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 好男人电影高清在线观看| 亚洲欧美日韩东京热| 久久人妻av系列| 精品无人区乱码1区二区| 免费人成视频x8x8入口观看| 久久这里只有精品中国| 在线天堂最新版资源| 一区二区三区国产精品乱码| 女人被狂操c到高潮| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 丰满人妻一区二区三区视频av | 亚洲 国产 在线| 国产精品99久久久久久久久| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 制服人妻中文乱码| 国产麻豆成人av免费视频| а√天堂www在线а√下载| 日韩欧美三级三区| 无遮挡黄片免费观看| 人妻夜夜爽99麻豆av| 成人特级黄色片久久久久久久| 99久久精品一区二区三区| 亚洲avbb在线观看| 麻豆国产av国片精品| 欧美性感艳星| 他把我摸到了高潮在线观看| 亚洲 国产 在线| 欧美+日韩+精品| 国产av一区在线观看免费| 真人一进一出gif抽搐免费| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 久久久久国内视频| 亚洲精品国产精品久久久不卡| avwww免费| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产精品1区2区在线观看.| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 亚洲最大成人手机在线| 最近最新中文字幕大全免费视频| 久久久久久久久久黄片| 国产乱人视频| 搞女人的毛片| 国产精品永久免费网站| 天堂√8在线中文| 成人鲁丝片一二三区免费| 嫩草影院精品99| 日本 av在线| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲欧美日韩东京热| 啦啦啦韩国在线观看视频| 99久国产av精品| 久久九九热精品免费| 麻豆国产97在线/欧美| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 欧美最黄视频在线播放免费| 两个人看的免费小视频| 国产成人啪精品午夜网站| 成年免费大片在线观看| 欧美色视频一区免费| 日韩av在线大香蕉| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 成人三级黄色视频| 日韩欧美精品v在线| 欧美三级亚洲精品| 天天一区二区日本电影三级| 真人做人爱边吃奶动态| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 国产成人欧美在线观看| 欧美乱妇无乱码| 99国产精品一区二区蜜桃av| 啪啪无遮挡十八禁网站| 18美女黄网站色大片免费观看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 最近最新中文字幕大全电影3| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 成人精品一区二区免费| 久久久久免费精品人妻一区二区| 亚洲av成人精品一区久久| 精品久久久久久久久久免费视频| 成人精品一区二区免费| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 高清在线国产一区| 在线视频色国产色| 动漫黄色视频在线观看| 757午夜福利合集在线观看| www日本在线高清视频| 18+在线观看网站| 脱女人内裤的视频| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 丰满人妻一区二区三区视频av | 亚洲一区二区三区不卡视频| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产精品 欧美亚洲| 淫妇啪啪啪对白视频| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲av成人精品一区久久| 国产综合懂色| 久久久久精品国产欧美久久久| 欧美最黄视频在线播放免费| 脱女人内裤的视频| 中文字幕久久专区| 国产又黄又爽又无遮挡在线| www.熟女人妻精品国产| 成人亚洲精品av一区二区| 婷婷丁香在线五月| 欧美国产日韩亚洲一区| 亚洲不卡免费看| 成年女人毛片免费观看观看9| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 午夜激情欧美在线| 国产麻豆成人av免费视频| 日本黄色片子视频| 欧美中文日本在线观看视频| 国产精品永久免费网站| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 大型黄色视频在线免费观看| 亚洲成人久久性| 悠悠久久av| 此物有八面人人有两片| 波多野结衣高清无吗| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 欧美bdsm另类| 97碰自拍视频| 在线观看av片永久免费下载| 日韩免费av在线播放| 嫩草影视91久久| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 激情在线观看视频在线高清| 国产单亲对白刺激| 精品无人区乱码1区二区| 观看美女的网站| 天美传媒精品一区二区| 免费大片18禁| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 一区福利在线观看| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 精品国产三级普通话版| 欧美又色又爽又黄视频| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 精品久久久久久久久久久久久| 国产高清videossex| 精品久久久久久久久久久久久| 色综合欧美亚洲国产小说| 天堂影院成人在线观看| 国产成人a区在线观看| 国产激情欧美一区二区| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 精品久久久久久久久久免费视频| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲人成网站高清观看| 日韩欧美国产在线观看| 夜夜躁狠狠躁天天躁| svipshipincom国产片| 日本一二三区视频观看| 中文字幕熟女人妻在线| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| or卡值多少钱| 国产精品爽爽va在线观看网站| 淫秽高清视频在线观看| 成人特级av手机在线观看| 国产高清有码在线观看视频| 九九热线精品视视频播放| 国产高清视频在线观看网站| 亚洲av电影在线进入| 国产精品日韩av在线免费观看| 深爱激情五月婷婷| 精品免费久久久久久久清纯| 狠狠狠狠99中文字幕| 最近最新中文字幕大全免费视频| 亚洲精品久久国产高清桃花| 免费搜索国产男女视频| 天美传媒精品一区二区| 一个人免费在线观看电影| 亚洲国产精品成人综合色| 亚洲av熟女| 久久亚洲真实| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 欧美一区二区亚洲| 听说在线观看完整版免费高清| 中文字幕熟女人妻在线| 母亲3免费完整高清在线观看| 51国产日韩欧美| 很黄的视频免费| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲久久久久久中文字幕| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 欧美国产日韩亚洲一区| 国产激情欧美一区二区| 国产精品亚洲一级av第二区| 五月伊人婷婷丁香| 亚洲精华国产精华精| 成熟少妇高潮喷水视频| 欧美日本视频| 日本与韩国留学比较| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 亚洲成av人片免费观看| 脱女人内裤的视频| 亚洲中文字幕日韩| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 欧美日韩乱码在线| 国产成人欧美在线观看| 久久精品国产综合久久久| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 欧美日韩黄片免| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 一个人观看的视频www高清免费观看| 久久久国产成人精品二区| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 香蕉久久夜色| 婷婷亚洲欧美| 亚洲精品一区av在线观看| 欧美高清成人免费视频www| 欧美乱色亚洲激情| 国产探花极品一区二区| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产精品1区2区在线观看.| 日本成人三级电影网站| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 毛片女人毛片| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 亚洲成人免费电影在线观看| 九色成人免费人妻av| 日韩有码中文字幕| a级一级毛片免费在线观看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 久久久久久久久大av| 欧美一区二区国产精品久久精品| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 俄罗斯特黄特色一大片| 18美女黄网站色大片免费观看| 亚洲人成电影免费在线| 日本黄色片子视频| 国产成人av教育| 51国产日韩欧美| 观看免费一级毛片| 又粗又爽又猛毛片免费看| 国产极品精品免费视频能看的| 757午夜福利合集在线观看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 欧美三级亚洲精品| 不卡一级毛片| 欧美+亚洲+日韩+国产| 午夜影院日韩av| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲自拍偷在线| 亚洲精品一区av在线观看| 美女黄网站色视频| 成年女人永久免费观看视频| 亚洲av电影在线进入| 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 国模一区二区三区四区视频| 亚洲精品久久国产高清桃花| 真人一进一出gif抽搐免费| 51国产日韩欧美| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| xxxwww97欧美| 操出白浆在线播放| 国内精品久久久久久久电影| 成人鲁丝片一二三区免费| 日本在线视频免费播放| 天堂网av新在线| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 又黄又粗又硬又大视频| 老司机在亚洲福利影院| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 午夜影院日韩av| 国产精品av视频在线免费观看| 草草在线视频免费看| 亚洲18禁久久av| 亚洲性夜色夜夜综合| 免费搜索国产男女视频| 精品欧美国产一区二区三| 很黄的视频免费| 欧美极品一区二区三区四区| 免费一级毛片在线播放高清视频| 国产午夜精品论理片| 国产精品1区2区在线观看.| 国产极品精品免费视频能看的| 亚洲成人久久性| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产高清激情床上av| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产不卡一卡二| 国产成年人精品一区二区| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产精品,欧美在线| 香蕉丝袜av| 免费大片18禁| 性色avwww在线观看| www.熟女人妻精品国产| 国产精品99久久99久久久不卡| 久久这里只有精品中国| 国产av不卡久久| 亚洲av一区综合| 俺也久久电影网| 高清毛片免费观看视频网站| 三级毛片av免费| 99久国产av精品| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 中文资源天堂在线| 伊人久久精品亚洲午夜| 男女午夜视频在线观看| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 岛国在线免费视频观看| 精品一区二区三区视频在线 | 天堂网av新在线| 成人永久免费在线观看视频| ponron亚洲| 丰满的人妻完整版| 亚洲七黄色美女视频| 校园春色视频在线观看| 亚洲专区国产一区二区| 黄片小视频在线播放| 天天添夜夜摸| 一级作爱视频免费观看| 欧美色欧美亚洲另类二区| 欧美大码av| 91九色精品人成在线观看| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 人人妻人人澡欧美一区二区| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产高清有码在线观看视频| 欧美成狂野欧美在线观看| 亚洲欧美精品综合久久99| 久久国产精品人妻蜜桃| 成人精品一区二区免费| 亚洲精品亚洲一区二区| 精品国产三级普通话版| 久久香蕉国产精品| 一本一本综合久久| 欧美中文综合在线视频| av专区在线播放| 国产精品亚洲一级av第二区| 久久人人精品亚洲av| 国产精品,欧美在线| 最后的刺客免费高清国语| 日本黄色片子视频| netflix在线观看网站| 久久精品人妻少妇| 香蕉av资源在线| av视频在线观看入口| 亚洲欧美激情综合另类| 欧美一级毛片孕妇| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 少妇的逼水好多| 成年女人看的毛片在线观看| 国产色爽女视频免费观看| 国产乱人伦免费视频| 91字幕亚洲| 日本 av在线| 免费人成视频x8x8入口观看| 可以在线观看毛片的网站| 国产真实伦视频高清在线观看 | 听说在线观看完整版免费高清| 人妻夜夜爽99麻豆av| av欧美777| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 毛片女人毛片| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲av二区三区四区| 精品国产三级普通话版| 国产黄色小视频在线观看| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 大型黄色视频在线免费观看| 久久香蕉国产精品| 成年人黄色毛片网站| 成人18禁在线播放| 一个人看视频在线观看www免费 | 欧美av亚洲av综合av国产av| 精品久久久久久久毛片微露脸| 在线观看日韩欧美| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 岛国视频午夜一区免费看| 69av精品久久久久久| www.熟女人妻精品国产| 99视频精品全部免费 在线| 男女午夜视频在线观看| 18禁在线播放成人免费| 很黄的视频免费| 国产精品1区2区在线观看.| 精品国产美女av久久久久小说| 午夜老司机福利剧场| 美女被艹到高潮喷水动态| 国产成人系列免费观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 内射极品少妇av片p| 国产精品av视频在线免费观看| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲久久久久久中文字幕| ponron亚洲| av在线天堂中文字幕| 国产成人啪精品午夜网站| 欧美日韩国产亚洲二区| 3wmmmm亚洲av在线观看| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲在线观看片| 久久国产乱子伦精品免费另类| 极品教师在线免费播放| 桃色一区二区三区在线观看| 老司机深夜福利视频在线观看| 日本 av在线| 91在线精品国自产拍蜜月 | 首页视频小说图片口味搜索| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产爱豆传媒在线观看| 91久久精品国产一区二区成人 | 中文字幕精品亚洲无线码一区| 亚洲第一电影网av| 精品不卡国产一区二区三区| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 内射极品少妇av片p| 亚洲人成伊人成综合网2020| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 丁香欧美五月| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 又紧又爽又黄一区二区| 国产真人三级小视频在线观看| 一本久久中文字幕| 国产精品电影一区二区三区| 精品人妻偷拍中文字幕| 久久久久久久午夜电影| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国产成人福利小说| 美女 人体艺术 gogo| 久久久久免费精品人妻一区二区| 久久欧美精品欧美久久欧美| 91久久精品国产一区二区成人 | 99久久成人亚洲精品观看| 国产免费男女视频| av国产免费在线观看| 在线观看午夜福利视频| 亚洲人成伊人成综合网2020| 看黄色毛片网站| 成人三级黄色视频| 免费看美女性在线毛片视频| 久久草成人影院| 90打野战视频偷拍视频| 久久午夜亚洲精品久久| 欧美激情久久久久久爽电影| 热99在线观看视频| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 欧美日韩乱码在线| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产高清激情床上av| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲色图av天堂| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 国产成人欧美在线观看| 欧美日韩综合久久久久久 | 最近最新中文字幕大全电影3| 欧美又色又爽又黄视频| 美女cb高潮喷水在线观看| www日本在线高清视频| 国产一区二区激情短视频| e午夜精品久久久久久久| 久久国产精品影院| 天天添夜夜摸| 久久久精品大字幕| 日本 av在线| 亚洲欧美精品综合久久99| 日韩免费av在线播放| 母亲3免费完整高清在线观看| 久久精品国产综合久久久| 3wmmmm亚洲av在线观看| tocl精华| 白带黄色成豆腐渣| 51午夜福利影视在线观看| 99热这里只有是精品50| 国产一区在线观看成人免费| 午夜免费激情av| 在线观看舔阴道视频| 国产精品久久久人人做人人爽| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 手机成人av网站| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 午夜老司机福利剧场| 人人妻人人看人人澡| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 青草久久国产| 男女那种视频在线观看| 国产av麻豆久久久久久久| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 三级国产精品欧美在线观看| 最近视频中文字幕2019在线8| 久久国产精品人妻蜜桃| 久久久成人免费电影| 精品午夜福利视频在线观看一区| 啦啦啦免费观看视频1| 欧美日韩福利视频一区二区| 又黄又爽又免费观看的视频| 极品教师在线免费播放| 9191精品国产免费久久| 日韩欧美三级三区| 国产精品永久免费网站| 此物有八面人人有两片| 午夜老司机福利剧场| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| АⅤ资源中文在线天堂| 色综合欧美亚洲国产小说| 不卡一级毛片| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 久久这里只有精品中国| 性欧美人与动物交配| 国产精品久久久久久久电影 | 在线免费观看不下载黄p国产 | 国产伦人伦偷精品视频| av专区在线播放| 精品乱码久久久久久99久播| 校园春色视频在线观看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 欧美zozozo另类| 国产精品亚洲美女久久久| 嫩草影院精品99| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产真人三级小视频在线观看| 91在线精品国自产拍蜜月 | 少妇的逼水好多| 色吧在线观看| 久久草成人影院| 亚洲 国产 在线| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 亚洲av日韩精品久久久久久密| 制服人妻中文乱码| 一a级毛片在线观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 久99久视频精品免费| 中文字幕av成人在线电影| 一级作爱视频免费观看| 久久国产精品影院| 极品教师在线免费播放| 波多野结衣巨乳人妻| 久久欧美精品欧美久久欧美| 日本a在线网址| 免费看日本二区| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 午夜福利欧美成人| 老司机午夜十八禁免费视频| 久久国产精品影院| 久久久精品欧美日韩精品| 三级毛片av免费| 麻豆成人av在线观看| 天美传媒精品一区二区| 日日夜夜操网爽| 3wmmmm亚洲av在线观看| 久久性视频一级片| 欧美日本视频| 欧美黑人欧美精品刺激| 午夜久久久久精精品| 村上凉子中文字幕在线| bbb黄色大片| 亚洲专区中文字幕在线| 亚洲精品久久国产高清桃花| 搞女人的毛片| 九九热线精品视视频播放| 99热这里只有是精品50| 国产一区在线观看成人免费| 国内精品久久久久久久电影| netflix在线观看网站| 久久久久久久久大av| 亚洲av成人av| 黄色丝袜av网址大全| 老熟妇仑乱视频hdxx| 久久精品91无色码中文字幕| 日韩欧美在线乱码| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 可以在线观看毛片的网站| 精品国产美女av久久久久小说| 三级毛片av免费| 精品一区二区三区人妻视频| 久久性视频一级片| 亚洲色图av天堂| 男女床上黄色一级片免费看| 欧美中文日本在线观看视频| 午夜免费成人在线视频| 免费观看的影片在线观看| 欧美激情久久久久久爽电影| 免费搜索国产男女视频| 老司机深夜福利视频在线观看| 男女之事视频高清在线观看| 国产精品99久久久久久久久| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| а√天堂www在线а√下载| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲av熟女| h日本视频在线播放| 亚洲国产精品成人综合色| 免费无遮挡裸体视频| 免费搜索国产男女视频| 久久国产精品影院|