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    東北紅豆杉多糖的化學(xué)研究

    2012-11-24 06:59:30姜瑞芝姜翔之曹傳英陳英紅高其品
    關(guān)鍵詞:糖醛酸單糖紅豆杉

    姜瑞芝,姜翔之,曹傳英,陳英紅,王 穎,高其品

    1吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院,長春130012;2吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院;3吉林大學(xué);4長春中醫(yī)藥大學(xué)研發(fā)中心,長春130021

    東北紅豆杉多糖的化學(xué)研究

    姜瑞芝1,姜翔之2,曹傳英3,陳英紅1,王 穎1,高其品4*

    1吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院,長春130012;2吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院;3吉林大學(xué);4長春中醫(yī)藥大學(xué)研發(fā)中心,長春130021

    利用水提醇沉提取東北紅豆杉多糖TP,經(jīng)超濾得到超濾外液TP-1和內(nèi)液TP-2。TP-2進(jìn)行部分酸水解和凝膠柱層析分離純化,得到TP-2-1a。通過對理化性質(zhì)、分子量、單糖組成和甲基化測定結(jié)果分析,確定其分子量分布在7.0 kDa左右,糖組成由Rha、Man、Gal、Glu、GalA和GlcA構(gòu)成,摩爾比為:16.9∶1.0∶15.5∶1.3∶9.9∶2.5,中性糖以Gal的1→3、1→4連接為主,在1→3連接的O-6位上有分支;Rha以1→2連接為主,在O-4位上有分支;Man以1→4、1→6連接為主;Glu以1→3、1→4連接為主;非還原末端主要是Gal及少量的Man、Glu和Rha。酸性糖以1→4連接GalA為主,無分支。該多糖為首次從東北紅豆杉中分離得到。

    東北紅豆杉;多糖;HPLC;GC-MS

    東北紅豆杉(Taxus cuspidate),又稱紫杉,為珍稀藥用資源。1971年,美國科學(xué)家首次從該屬植物中分離得到的紫杉醇被證明具有顯著的抗腫瘤活性[1],隨后對其進(jìn)行了大量的研究,得到了400多種紫杉烷類化合物[2,3]。近10年來,該屬植物中的多糖類化合物的藥理活性逐漸引起了人們的關(guān)注[4,5],但相關(guān)化學(xué)研究甚少,尤其在多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)方面尚未見報道。本實驗從東北紅豆杉的地上部分提取分離了糖蛋白部分,并確定了糖部分的理化性質(zhì)和化學(xué)結(jié)構(gòu)。

    1 材料和方法

    1.1 試劑與儀器

    東北紅豆杉地上部分為本實驗室采集。標(biāo)準(zhǔn)品牛血清白蛋白(ABS)、葡萄糖(Glc)、鼠李糖(Rha)、巖藻糖(Fuc)、阿拉伯糖(Ara)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)、半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖醛酸(GlcA)均購自Sigma公司,純度為99%。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)等試劑均為國產(chǎn)分析純。

    752紫外分光光度計為上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;LC-2010高效液相色譜儀為日本島津公司產(chǎn)品,Diamonsil C18柱(Φ4.6 mm×250 mm); 10AT-VP高效液相色譜儀,示差折光檢測器為日本島津公司產(chǎn)品,OHpaK SB-804HQ凝膠色譜分析柱(Φ8 mm×300 m),GPC軟件;中空纖維超濾系統(tǒng)為北京旭邦膜設(shè)備有限責(zé)任公司產(chǎn)品;氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS)為Trace-MS美國FINGAN。

    東北紅豆杉地上部分由吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院資源所徐國經(jīng)副教授鑒定為Taxus cuspidate。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 TP、TP-1、TP-2的提取分離

    東北紅豆杉地上部分50 kg,剪碎,加12倍量水煎煮三次,每次3 h,提取液濃縮,加乙醇至醇濃度70%,靜置過夜,離心,沉淀加少量水溶解,凍干,得TP 320 g。

    取TP 200 g,加水溶解,經(jīng)中空纖維柱超濾(截留分子量為10 K),得超濾液(TP-1)和濃縮液(TP-2)兩部分,濃縮凍干,分別得39 g和82 g。

    1.2.2 TP-1和TP-2分子量測定

    采用HPLC凝膠柱色譜法,以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖Dextran T系列制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(流動相:0.7%Na2SO4溶液,流速為0.5 mL/min,柱溫35℃),樣品同行,利用GPC軟件計算其分子量。

    1.2.3 TP-1和TP-2中無機(jī)元素組成及含量

    采用ICP法測定TP-1和TP-2中無機(jī)元素組成及含量。

    1.2.4 TP-1對蒸餾水透析

    對TP-1進(jìn)行蒸餾水透析(截流分子量3000),透析內(nèi)液濃縮,凍干得TP-1a。

    1.2.5 TP、TP-1、TP-2和TP-1a理化性質(zhì)測定

    采用lowry法[6](以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品)、間羥基聯(lián)苯法[7](以半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品)、苯酚-硫酸法[8](以半乳糖為標(biāo)準(zhǔn)品)測定蛋白質(zhì)、糖醛酸及中性糖的含量。

    1.2.6 糖醛酸對中性糖含量測定的干擾[9]

    配制GalA標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為248 μg/mL,按照苯酚-硫酸法制作糖醛酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.2.6.2 排除酸性糖干擾的中性糖含量測定

    移取一定量的樣品,計算出其所含糖醛酸質(zhì)量數(shù),并代入苯酚-硫酸法測定以糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算其吸收值(記作A1)。苯酚-硫酸法測得的相同取樣量的吸收值(記作A0),減去A1后代入苯酚-硫酸法測定以半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算其含量。

    1.2.7 TP-2的部分酸水解

    取TP-2 5 g加0.9%硫酸50 mL,95℃恒溫水浴3 h,加BaCO3中和,離心,取上清液加入五倍的乙醇,離心,分別得沉淀TP-2-1和上清TP-2-2。

    1.2.8 TP-2-1和TP-2-2的分子量測定

    按實驗1.2.2方法操作。

    然而,時刻保持對世界的善意,對每一個人的理解與包容,幾乎每一天,我都在內(nèi)心進(jìn)行自我教育。也相信,每一個,尤其是身邊人,也都會如此。事實上我錯了,我們周邊人心的繁復(fù)與幽深,溫良與狂躁,古老而新鮮的惡,尤其是不自覺的惡意,就像是隱藏的匕首和投槍,時不時锃亮出鞘,狠狠地將我們教育一次。由此我也再一次認(rèn)為,其實善惡原本都是天性中攜帶的,只不過,有些人因為后天文化修養(yǎng),特別是在世事洞明之后覺醒了,進(jìn)而內(nèi)心和精神當(dāng)中,飽含誠摯與善意;而另一些人,則在現(xiàn)實生活中,由于自己的不夠強大,而生怕失去了眼前既有的利益,遭遇對自己不利的情況,雷光電火,頃刻爆發(fā)。

    1.2.9 TP-2、TP-2-1、TP-2-2的單糖組成分析[10]

    取標(biāo)準(zhǔn)品單糖溶液(2 mmol/L)各5 mL,各加6 mL 0.5 mol/L PMP甲醇溶液,加5 mL 0.3 mol/L NaOH,70℃水浴0.5 h,加5 mL 0.3 mol/L HCL中和,用等體積氯仿萃取3次,取水層放置過夜,制得標(biāo)準(zhǔn)單糖PMP衍生物。取樣品各20 mg,加2 mol/L三氟乙酸2 mL,110℃水解12 h,放置室溫,衍生化方法同上,制得樣品PMP衍生物,分別取標(biāo)準(zhǔn)品和樣品PMP衍生物進(jìn)行單糖組成分析。

    高效液相色譜條件:Diamonsil C18柱,柱溫:40℃,流動相:A-磷酸緩沖液(pH=6.8):乙睛(85∶15,V/V);B-磷酸緩沖液(pH=6.8):乙睛(60∶40,V/ V),流速:0.9 mL/min,波長:250 nm。進(jìn)樣量10 μL。

    1.2.10 TP-2-1的分離純化

    取TP-2-1 300 mg,溶于30 mL蒸餾水中,上Sephadex G-75柱(Φ2.5 cm×120 cm),用蒸餾水洗脫,部分收集器收集7 mL/管。間管用苯酚-硫酸在A490nm處監(jiān)測。以收集的管數(shù)為橫坐標(biāo),以糖的吸收值為縱坐標(biāo)繪制吸收曲線。根據(jù)吸收曲線圖形分得到兩部分TP-2-1a和TP-2-1b,凍干,分別得186 mg和45 mg。

    1.2.11 TP-2-1a的單糖組成分析

    按實驗1.2.7方法操作。

    1.2.12 TP-2-1a的分子量測定

    按實驗1.2.2方法操作。

    1.2.13 TP-2-1a的糖苷鍵連接方式分析

    采用改良的Hakomori[11]和Valent[12]法,對TP-2-1a分別進(jìn)行中性糖及酸性糖部分糖苷鍵連接方式分析。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 理化性質(zhì)測定

    東北紅豆杉地上部分通過水提醇沉得到TP,理化性質(zhì)測定結(jié)果為,總糖含60.39%,蛋白質(zhì)含26.96%,收率為3.2%。利用中空纖維超濾將TP分為超濾外液TP-1和濃縮液TP-2兩部分,收率分別為19%和42%,分子量各分布在1.5和20 kDa左右。理化性質(zhì)結(jié)果顯示,TP-1的總糖和蛋白質(zhì)含量之和僅占總固體物的30%,通過ICP元素分析,TP-1和TP-2中無機(jī)元素分別占19.7%和3.0%,說明TP-1中含有大量的無機(jī)鹽,經(jīng)透析得到TP-1a,各樣品的理化性質(zhì)測定結(jié)果見表1。東北紅豆杉多糖為酸性雜多糖,且酸性糖含量很高,由于酸性糖的存在,對中性糖的含量測定會產(chǎn)生很大的干擾,所以表1中在未排除干擾時所測的中性糖、蛋白質(zhì)和糖醛酸含量之和超過100%,為使測定結(jié)果更真實,實驗“1.2.6”為排除酸性糖干擾試驗,標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y= 4.2×10-3+1.02×10-3X,經(jīng)測定與計算后,得出無干擾的中性糖含量(見表1)。

    表1 各多糖樣品理化性質(zhì)測定結(jié)果Table 1 Physical and chemical properties of the polysaccharide samples

    2.2 TP-2組成糖分析

    實驗對TP-2進(jìn)行部分酸水解,經(jīng)乙醇沉淀,分別得到沉淀TP-2-1和上清TP-2-2兩部分,分子量分布在20-0.1 kDa和0.5-0.1 kDa之間,表明TP-2-1為多糖部分,TP-2-2為寡糖和單糖。組成糖結(jié)果表明,TP-2-1中主要含有Rha、Gal和GalA,表明TP-2的主鏈部分應(yīng)由此3種單糖構(gòu)成。TP-2-2中主要含有Ara,不含GalA和GlcA,說明TP-2的側(cè)鏈或末端主要是Ara和少量的Man、Gal和Glc構(gòu)成,酸性糖均存在于主鏈中。組成糖結(jié)果見表2。

    表2 TP-2組成糖分析結(jié)果(各組成單糖摩爾比)Table 2 Results of sugar composition analysis of TP-2(molar ratio of monosaccaride composition)

    2.3 TP-2-1a的單糖組成分析

    實驗利用Sephadex G-75凝膠柱層析對TP-2-1進(jìn)行分離純化,得到TP-2-1a、TP-2-1b兩部分,收率分別為62%和9.2%,分子量測定結(jié)果為7 kDa和0.35 kDa,結(jié)果見圖1。TP-2-1a的組成糖主要由Rha、Gal、GalA,及少量的Glu、Man和GlcA構(gòu)成,其摩爾比6.9∶15.5∶9.9∶1.3∶1∶2.5,結(jié)果見圖2。

    2.4 TP-2-1a甲基化分析

    甲基化結(jié)果表明,TP-2-1a的中性糖連接方式為:以Gal的1→3、1→4連接為主,在1→3連接的O-6位上有分支;Rha以1→2連接為主,在O-4位上有分支;Man以1→4、1→6連接為主;Glu以1→3、1→4連接為主;非還原末端主要是Gal,及少量的Man、Glu和Rha。結(jié)果見表3。

    圖3 MS中顯示出GalA的分子離子峰,經(jīng)氘代四氫鋁鋰還原后的m/z值要比相應(yīng)中性糖片段的m/z值多2。MS中出現(xiàn)的235分子離子峰是GalA氘代特征峰,此峰確定GalA的連接方式為1→4連接。GlcA由于含量低,甲基化結(jié)果尚未確定。

    表3 TP-2-1a甲基化分析結(jié)果Table 3 Methylation results of TP-2-1a

    圖3 TP-2-1a中GalA-6-D2的MS圖Fig.3 MS of GalA-6-D2 from TP-2-1a

    2.5 結(jié)論

    東北紅豆杉中含有豐富的多糖類化合物,實驗中對TP的多糖部分通過部分酸水解、分離純化及其理化性質(zhì)、組成糖、糖苷鍵連接方式進(jìn)行了系統(tǒng)研究,確定了TP糖部分的平均結(jié)構(gòu)為:

    其側(cè)鏈(SC)為:1→3連接、1→4連接的Gal,且在1→3連接的Gal的6位上有分支;以及少量的1→4連接、1→6連接Man、少量的1→3連接、1→4連接Glu;非還原末端主要是Gal。該研究結(jié)果為今后進(jìn)一步開發(fā)東北紅豆杉大分子多糖奠定了基礎(chǔ)。

    1 Wang CL(王春霖),Cao CM(曹聰梅),Zhang ML(張嫚麗),et al.Research progress in Taxanes compounds.Hebei Med J(河北醫(yī)藥),2005,27:684-688.

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    3 Cao CM(曹聰梅),Li ZP(李作平),Shi QW(史清文).Chemical constituents in Taxus cuspidate and their bioactivities.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā)),2006,18:330-342.

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    Chemical Analysis of Polysaccharides from Taxus cuspidate

    JIANG Rui-zhi1,JIANG Xiang-zhi2,CAO Chuan-ying3,CHEN Ying-hong1,WANG Ying1,GAO Qi-pin4*1Jilin Province Academy of Chinese Medicine and Material Medica Science,Changchun 130012,China;2China-Japan Union Hospital of Jilin University;3Jilin University;4Center for New Medicine Research,Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130021,China

    TP was obtained by water extraction and alcohol precipitation from Taxus cuspidate.TP was filtrated through a cellulose ultrafiltration system to give the extra-ultrafiltrate with TP-1 and intro-ultrafiltrate with TP-2.TP-2 was treated with partially acid hydrolysis,then purified by Sephadex G-75 column to obtain the polysaccharides TP-2-1a.TP-2-1a was studied,including the physical and chemical properties,molecular weight,sugar compositions,glycosidic linkage analysis and so on.The molecular weight of TP-2-1a was about 7.0×103 kDa.Suger compositions were Rha,Man,Gal,Glu,GalA and GlcA,in molar ratio of 16.9∶1∶15.5∶1.3∶9.9∶2.5.The backbone of TP-2-1a were(1→3)and(1→4)-linked galactosyl,(1→4)and(1→6)-linked mannosyl,(1→3)and(1→4)-linked glucosyl,and(1→4)-linked galacturonide,There were side chains attached to O-6 of(1→3)-linked galactoside and O-4 of(1→2)-linked rhamnoside.And the non-reducing terminals were mostly galactose and a few mannose,glucose and rhamnose.This is the first time to obtain the polysaccharides from T.cuspidate.

    Taxus cuspidate;polysaccharides;HPLC;GC-MS

    1001-6880(2012)04-0440-04

    2011-05-31 接受日期:2011-12-23

    *通訊作者 Tel:86-431-86058667;E-mail:gaoqipin@sina.com

    R932

    A

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