低聚殼聚糖與α-丙氨酸/天冬酰胺的美拉德反應(yīng)及其衍生物的抗氧化性能研究

孫 濤，朱 云，謝 晶，薛 斌，毛 芳

1上海海洋大學(xué)食品學(xué)院;2上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)研究院，上海201306

低聚殼聚糖與α-丙氨酸/天冬酰胺的美拉德反應(yīng)及其衍生物的抗氧化性能研究

孫 濤1，2*，朱 云1，謝 晶1，薛 斌1，毛 芳1

1上海海洋大學(xué)食品學(xué)院;2上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)研究院，上海201306

研究低聚殼聚糖(COS)與α-丙氨酸/天冬酰胺的美拉德反應(yīng)，考察了兩個體系(低聚殼聚糖的羰基與氨基的物質(zhì)量比均為1∶1)的pH、吸光度和熒光值的變化。醇沉法提取低聚殼聚糖衍生物CA和CN。對兩種衍生物進行紅外表征和分子量測定，并研究其對超氧陽離子、DPPH自由基的清除能力以及還原能力。結(jié)果顯示：抗氧化能力強弱次序為CA＞CN＞COS，即美拉德反應(yīng)后低聚殼聚糖衍生物抗氧化能力得到顯著提高，且CA的抗氧化活性優(yōu)于CN，表明與小分子氨基酸進行美拉德反應(yīng)制得的殼聚糖衍生物具有更好的抗氧化性。

低聚殼聚糖;α-丙氨酸;天冬酰胺;美拉德反應(yīng);抗氧化性能

美拉德反應(yīng)是多指發(fā)生在食品加工和貯存過程中還原糖的羰基與蛋白質(zhì)、氨基酸及一些含氮化合物的氨基產(chǎn)生的一系列復(fù)雜反應(yīng)的集合，且產(chǎn)物結(jié)構(gòu)復(fù)雜、種類繁多，這與反應(yīng)溫度、時間以及參與反應(yīng)的氨基酸等有一定的關(guān)聯(lián)［1］。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物含有類黑精、還原酮及一系列含N、S的雜環(huán)化合物，這類物質(zhì)具有一定的抗氧化性能，其抗氧化活性可以與食品中常用的抗氧化劑相當(dāng)［2］。

低聚殼聚糖的抗氧化作用日益受到廣泛關(guān)注，低聚殼聚糖可以作為羰基的供應(yīng)體與氨基酸發(fā)生美拉德反應(yīng)。本文以美拉德反應(yīng)作為低聚殼聚糖改性的手段，與α-丙氨酸和天冬酰胺反應(yīng)制得低聚殼聚糖衍生物，監(jiān)控了反應(yīng)過程中pH、吸光度以及熒光值的變化，考察了其對、DPPH的清除能力以及還原能力，為拓寬低聚殼聚糖的改性和開發(fā)天然高效的抗氧化劑提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

低聚殼聚糖(純度＞90%，脫乙酰度＞70%，凝膠色譜測定其分子量為9370 Da)，購自浙江金殼生物化學(xué)有限公司;魯米諾，DPPH，購自Sigma公司; α-丙氨酸，天冬酰胺，購自國藥集團(滬試);其余試劑均為分析純，購自上海化學(xué)試劑公司;抗氧化測試所需溶液由二次蒸餾水配制。

1.2 主要設(shè)備和儀器

WFZ UV2000型紫外分光光度計(上海合利儀器有限公司);970CRT熒光分光光度計(南京昕航科學(xué)儀器有限公司);EQUNOX55傅立葉紅外-拉曼光譜儀(德國布魯克公司);Waters 2410型凝膠色譜儀(美國Waters公司);IFFM 2D型流動注射化學(xué)發(fā)光分析儀(西安瑞邁科技有限公司)。

1.3 低聚殼聚糖衍生物的制備

稱取低聚殼聚糖20.0 g兩份，加入α-丙氨酸2.61 g/天冬酰胺3.87 g，使得低聚殼聚糖羰基和α-丙氨酸/天冬酰胺的氨基物量比為1∶1。用200 mL的二次蒸餾水溶解，在80℃下回流反應(yīng)24 h，考察反應(yīng)過程中pH、吸光度以及熒光值的變化。反復(fù)醇沉提取與α-丙氨酸/天冬酰胺反應(yīng)的低聚殼聚糖衍生物CA和CN，為無味、深褐色粉末，得率分別為12.0%和32.3%。

1.4 測試表征

紅外光譜在EQUNOX55傅立葉紅外-拉曼光譜儀上進行，采用KBr壓片法制樣，測定波數(shù)范圍為500～4000 cm-1，分辨率為0.8 cm-1。

產(chǎn)物的相對平均分子質(zhì)量及其分布采用GPC法測定。GPC測試條件如下：流動相：0.1 mol/L醋酸鈉水溶液;監(jiān)測器：Waters 2410示差折光監(jiān)測器;柱子：TOSOH BIOSEP G4000SWXL;溫度：40℃;標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為：葡聚糖。

1.5 抗氧化性能測定

用pH=10.20的0.05 mol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液配制濃度為1.5×10-3mol/L的魯米諾溶液，用1×10-3mol/L的鹽酸配制濃度為0.1 mol/L的鄰苯三酚儲備液，使用前用去離子水稀釋至1× 10-4mol/L。以緩沖液作為溶劑，配制不同濃度的樣品溶液。用流動注射化學(xué)發(fā)光分析儀依次測定從稀到濃的樣品溶液，讀出峰面積［3］。清除率 =(A0-Ai)/A0×100%。其中A0為空白溶液峰面積;Ai為樣品溶液峰面積。經(jīng)SOD，過氧化氫酶及甘露醇檢測，該體系產(chǎn)生的自由基為超氧陰離子。

1.5.2 對DPPH自由基的清除

在比色管中加入2.0 mL的濃度為1×10-4mol/ L DPPH無水乙醇溶液，再加入不同濃度的樣品溶液2.0 mL，室溫下避光靜置半小時，在517 nm處測量吸光度Ai。用去離子水代替樣品溶液，得吸光度A0，無水乙醇代替DPPH，得吸光度Aj。清除率=［1-(Ai-Aj)/A0］×100%［4］。

1.5.3 還原能力的測定

pH=6.60的0.2 mol/L磷酸緩沖液和1%鐵氰化鉀溶液各2.5 mL，加入到2.0 mL不同濃度的樣品溶液中，混勻，50℃水浴20 min后迅速冷卻，加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，混勻后在3000 r/min下離心10 min，取上清液2.0 mL，加入2.5 mL去離子水和0.5 mL 0.1%的三氯化鐵溶液，靜置10 min后在700 nm處測定其吸光度［5］。

2 結(jié)果與分析

圖1 低聚殼聚糖與α-丙氨酸和天冬酰胺美拉德反應(yīng)過程中pH的變化Fig.1 The pH change of Maillard reaction with α-alanine/ asparagine

2.1 pH值的變化

圖2 低聚殼聚糖與α-丙氨酸/天冬酰胺美拉德反應(yīng)過程中在280 nm處的吸光度的變化Fig.2 The UV-Vis absorbance of Maillard reaction with αalanine/asparagine at 280 nm

pH變化影響美拉德反應(yīng)速率［6］。美拉德反應(yīng)中一般形成一些有機酸，如甲酸和乙酸［7，8］，引起體系pH下降。圖1為低聚殼聚糖與α-丙氨酸和天冬酰胺美拉德反應(yīng)過程中體系pH的變化圖。兩種反應(yīng)體系pH值均呈下降趨勢，其中低聚殼聚糖與天冬酰胺體系pH值下降較快，這可能是因為反應(yīng)速率較快，產(chǎn)生了較多的甲酸和乙酸。

圖3 低聚殼聚糖與α-丙氨酸/天冬酰胺美拉德反應(yīng)過程中在420 nm處的吸光度Fig.3 The UV-Vis absorbance of Maillard reaction with αalanine/asparagine at 420 nm

2.2 吸光度的變化

圖2、3描述了低聚殼聚糖分別與α-丙氨酸、天冬酰胺反應(yīng)過程中的紫外-可見吸收光譜在280 nm和420 nm處的吸光度。如圖所示，在280 nm處吸收峰有明顯增強，表明美拉德反應(yīng)過程中生成中間產(chǎn)物［9］，表明有新的物質(zhì)生成并不斷積累;在420 nm處吸收峰隨著反應(yīng)時間的延長而增強，且與α-丙氨酸反應(yīng)的體系增幅較大，表明美拉德反應(yīng)產(chǎn)物增多［9，10］。

在酸性條件下，美拉德反應(yīng)易發(fā)生糖的異構(gòu)和脫水，產(chǎn)生糠醛類物質(zhì)［11］。羥甲基糠醛是美拉德反應(yīng)的標(biāo)示物，在280 nm左右存在特征吸收峰［12］。紫外-可見吸收在280 nm和420 nm附近的吸收，分別代表美拉德中間產(chǎn)物羥甲基糠醛及褐變物質(zhì)的量［13］，如圖所示，美拉德反應(yīng)過程中褐變物質(zhì)在不斷積累。

圖4 低聚殼聚糖與α-丙氨酸和天冬酰胺美拉德反應(yīng)的過程中熒光值的變化Fig.4 The fluorescence absorbance of Maillard reaction with α-alanine/asparagine

2.3 熒光值的變化

熒光物質(zhì)被視為美拉德反應(yīng)的指示劑，因為它們靈敏地反映了美拉德反應(yīng)的早期過程，反應(yīng)后期熒光物質(zhì)將參與類黑素等大分子的形成，所以隨著反應(yīng)進行，熒光物質(zhì)的積累會越來越少［14］。

圖4描述的是在美拉德反應(yīng)過程中，低聚殼聚糖與α-丙氨酸體系在340 nm激發(fā)波長和438 nm發(fā)射波長以及低聚殼聚糖與天冬酰胺體系在343 nm激發(fā)波長和435 nm發(fā)射波長下的熒光強度。CA體系的熒光強度增強明顯，這表明具有熒光性質(zhì)的美拉德產(chǎn)物的產(chǎn)生和積累;CN體系的熒光強度增強緩慢。這可能由于與α-丙氨酸反應(yīng)體系熒光強度積累較快所致。

圖5 低聚殼聚糖以及兩種低聚殼聚糖美拉德衍生物的紅外圖Fig.5 FTIR spectra of COS，CA and CN

2.4 低聚殼聚糖美拉德產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)表征

圖5是低聚殼聚糖及其衍生物的紅外光譜圖。殼聚糖及兩種衍生物在1100 cm-1附近都有3個較強的多糖特征吸收峰，分別是895、1085 cm-1以及1155 cm-1，這些吸收峰都來自殼聚糖主鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，可作為判定低聚殼聚糖及其衍生物存在的特征吸收峰［4］。低聚殼聚糖在1621、1515 cm-1和1381 cm-1附近的吸附帶，分別歸因于酰胺I(C=O)、自由氨基(-NH2)和酰胺Ⅲ［15］。且CA和CN在1621、1515 cm-1和1381 cm-1的峰較低聚殼聚糖有所降低，表明了酰胺I(C=O)、自由氨基(-NH2)和酰胺Ⅲ的改變［16］，即低聚殼聚糖在美拉德反應(yīng)后結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。

圖6 低聚殼聚糖及其美拉德衍生物對超氧陰離子的清除能力Fig.6 Scavenging activities of COS，CA and CN on superoxide anion

采用Waters 2410型凝膠色譜儀，測得樣品低聚殼聚糖的分子量為5654，美拉德反應(yīng)制得的低聚殼聚糖衍生物CA、CN的分子量分別為5833和6391。美拉德衍生物的分子量較低聚殼聚糖都有所增加，表明低聚殼聚糖和氨基酸相互反應(yīng)形成了更大的分子。

圖7 低聚殼聚糖及其美拉德衍生物對DPPH的清除能力Fig.7 Scavenging activities of COS，CA and CN on DPPH radicals

2.6 對DPPH自由基的清除

圖7描述了殼聚糖及其衍生物對DPPH自由基的清除能力。兩種低聚殼聚糖衍生物CA和CN對DPPH自由基的清除能力均隨著濃度的增加，且優(yōu)于低聚殼聚糖，即抗氧化能力CA＞CN＞COS。這與對O-·2的清除效果保持一致。而CA和CN的IC50分別為0.21和0.47 mg/mL，可見CA對DPPH自由基的清除能力將近是CN的兩倍多。

2.7 還原能力的測定

抗氧化活性和還原能力之間存在著密切的關(guān)系［18］。如圖8所示，在濃度為2.5 mg/mL時，COS、 CN和CA的吸光度分別為0.48、0.55和1.03，還原能力強弱順序為CA＞CN＞COS，這與前面的結(jié)果保持一致。

圖8 低聚殼聚糖及其美拉德衍生物的還原能力測定Fig.8 Reducing power of COS，CA and CN

3 結(jié)論

本實驗以美拉德反應(yīng)為低聚殼聚糖的改性手段，分別與α-丙氨酸和天冬酰胺反應(yīng)來制備低聚殼聚糖衍生物，并檢測了低聚殼聚糖及其衍生物對、DPPH的清除能力以及還原能力。結(jié)果顯示，衍生物的抗氧化性均優(yōu)于低聚殼聚糖，故可以認為美拉德反應(yīng)是低聚殼聚糖改性的有效手段;低聚殼聚糖與α-丙氨酸美拉德反應(yīng)的衍生物抗氧化性更強，這可能是由于α-丙氨酸的分子較天冬酰胺小，更易于向羰基進攻發(fā)生美拉德反應(yīng)，生成的衍生物抗氧化性能也更強。表明低聚殼聚糖與α-丙氨酸的美拉德反應(yīng)是提高抗氧化性更有效的手段，其機理還有待進一步研究。本研究為制備天然、安全、高效的抗氧化劑提供了很好的思路。

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Maillard Reaction of Chitosan Oligosaccharide and α-Alanine/ Asparagine and Antioxidant Acticity of Their Derivatives

SUN Tao1，2*，ZHU Yun1，XIE Jing1，XUE Bin1，MAO Fang11College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University;2Institute of Marine Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China

Two kinds of the chitosan oligosaccharide derivatives were prepared through Maillard reaction by heating chitosan oligosaccharide and α-alanine/asparagine(the ratio of carbonyl group and amino group was 1∶1).The pH，absorbance and fluorescence were determined during the reaction.The chitosan oligosaccharide derivatives were characterized by FTIR and their molecular weight was determined by GPC.Their antioxidant activity was investigated by employing various established in vitro systems，such as superoxide，1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)radicals scavenging and reducing power.The results showed the chitosan oligosaccharide derivatives had strong antioxidant activity compared to chitosan oligosaccharide.The antioxidant activity was found to be in the order of CA＞CN＞COS.The results indicated that the derivatives prepared by chitosan oligosaccharide and α-alanine had better antioxidant activity than that prepared by chitosan oligosaccharide and asparagine.

chitosan oligosaccharide;α-alanine;asparagines;Maillard reaction;antioxidant activity

1001-6880(2012)04-0450-05

2011-05-03 接受日期：2011-07-29

“十二五”國家支撐計劃(2011BAD24BO2);上海市教委重點學(xué)科建設(shè)項目(J50704)

*通訊作者 Tel：86-21-61900363;E-mail：taosun@shou.edu.cn

R285;Q539;TS202.3

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