野葛、粉葛與云南葛中葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素的含量比較Δ

裴香萍，劉亞明，劉計(jì)權(quán)，李慧峰，李 晶（山西中醫(yī)學(xué)院，太原 030024）

野葛、粉葛與云南葛中葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素的含量比較Δ

裴香萍＊，劉亞明#，劉計(jì)權(quán)，李慧峰，李 晶（山西中醫(yī)學(xué)院，太原 030024）

目的：比較野葛、粉葛與云南葛中葛根素、大豆苷、大豆苷元和染料木素的含量。方法：樣品以30%乙醇回流提取后采用高效液相色譜法測(cè)定含量。 色譜柱為Uvis-201（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇-水（梯度洗脫），流速為1.0mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm，柱溫為室溫。結(jié)果：葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素的進(jìn)樣量分別在0.68～5.44μg（r＝0.9992）、0.143～1.144μg（r＝0.9993）、0.0245～0.1960μg（r＝0.9992）、0.088～0.704μg（r＝0.9994）范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好線(xiàn)性關(guān)系；平均加樣回收率分別為98.1%、99.5%、101.1%、99.2%，RSD分別為2.17%、2.42%、2.53%、2.65%（n均為6）。葛根素含量高低排序?yàn)楹幽弦案穑驹颇细穑旧轿饕案穑敬髣e山野葛＞廣西粉葛；大豆苷含量為云南葛＞河南野葛＞大別山野葛＞山西野葛＞廣西粉葛；大豆苷元含量為河南野葛＞云南葛＞山西野葛＞大別山野葛＞廣西粉葛；染料木素含量為河南野葛＞云南葛＞山西野葛＞大別山野葛＞廣西粉葛。結(jié)論：野葛、粉葛與云南葛中葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素含量差別較大，且云南葛為野葛的偽品之一，三者不能同等應(yīng)用。

野葛；粉葛；云南葛；葛根素；大豆苷；大豆苷元；染料木素；高效液相色譜法；含量；比較

葛根為豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd）.Ohwi的干燥根[1]，具有解肌退熱、生津透疹、升陽(yáng)止瀉的功效[2]。葛根的主要有效成分為葛根素、大豆苷、大豆苷元等異黃酮類(lèi)化合物[3]。大豆苷和大豆苷元具有治療和預(yù)防心肌梗死及心律失常，改善腦循環(huán)、周?chē)芗拔⒀h(huán)等心腦血管疾病，抗腫瘤及雌激素樣作用等多種藥理功效[4，5]。目前市場(chǎng)上除了野葛、粉葛（P.Thomsonii Benth.），還常見(jiàn)有云南葛（P.peduncularis Grah.）的根作為葛根在使用。云南葛[2]主要分布于云南、四川地區(qū)，又稱(chēng)苦葛。已有文獻(xiàn)報(bào)道葛根的指紋圖譜研究[6～9]、葛根中主要成分葛根素的含量測(cè)定、野葛與粉葛的對(duì)比研究[10]。為了進(jìn)一步比較不同品種之間物質(zhì)基礎(chǔ)的區(qū)別，進(jìn)而為臨床應(yīng)用提供參考，本試驗(yàn)采用高效液相色譜（HLPC）法測(cè)定并比較了野葛、粉葛、云南葛3個(gè)品種中葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素的含量，為不同品種葛根的開(kāi)發(fā)、臨床應(yīng)用與質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

426系列HPLC儀，含Allchromplus軟件（德國(guó)Alltech公司）；FA2014型電子分析天平（上海雷韻試驗(yàn)儀器制造有限公司）；KQ3200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：150W，頻率：40kHz）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海申勝生物技術(shù)有限公司）。

葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素對(duì)照品（成都思華生物技術(shù)公司，純度均＞98.0%）；甲醇為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。試驗(yàn)樣品均由同仁堂供貨商從不同產(chǎn)地供應(yīng)并由山西中醫(yī)學(xué)院中藥鑒定教研室牛燕珍實(shí)驗(yàn)師鑒定分別為野葛（來(lái)源分別為河南、山西、大別山）、粉葛（來(lái)源為廣西）、云南葛（來(lái)源為云南）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Uvis-201（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脫（洗脫程序見(jiàn)表1）；流速：1.0mL·min－1；柱溫：室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)：250nm。色譜見(jiàn)圖1。

表1 梯度洗脫條件Tab 1 Gradient elution conditions

圖1 高效液相色譜圖A.混合對(duì)照品；B.野葛；C.云南葛；D.粉葛；1.葛根素；2.大豆苷；3.大豆苷元；4.染料木素Fig 1 HPLC chromatograms A.mixed control；B.P.lobata；C.P.peduncularis；D.P.thomsonii；1.puerarin；2.daidzin；3.daidzein；4.genistein

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取大豆苷、大豆苷元、染料木素對(duì)照品分別為5.72、0.98、3.52mg，分別加甲醇溶解并定容至10mL量瓶中，即得大豆苷、大豆苷元、染料木素的對(duì)照品溶液。精密稱(chēng)取葛根素對(duì)照品2.72mg，置5mL量瓶中，精密加入大豆苷、大豆苷元、染料木素的對(duì)照品溶液各1mL，加甲醇溶解并定容，即得葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱(chēng)取野葛、云南葛各0.2g，粉葛1.8g，精密加入30%乙醇50mL，稱(chēng)重，加熱回流提取30min，放冷，再稱(chēng)重，用30%乙醇補(bǔ)足失重，取續(xù)濾液作為供試品溶液。經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，備用。

2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察

分別精密吸取混合對(duì)照品溶液0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00mL，置2mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得到葛根素濃度為0.068、0.136、0.204、0.272、0.408、0.544mg·mL－1，大豆苷濃度為 0.0143、0.0286、0.0429、0.0572、0.0858、0.1144mg·mL－1，大豆苷元濃度為0.00245、0.00490、0.00735、0.00980、0.01470、0.01960mg·mL－1，染料木素濃度為0.0088、0.0176、0.0264、0.0352、0.0528、0.0704mg·mL－1的系列混合對(duì)照品溶液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，進(jìn)樣10μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素的峰面積積分值。以進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得各成分的回歸方程和相關(guān)系數(shù)（r），詳見(jiàn)表2。結(jié)果表明，葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素的進(jìn)樣 量 分 別 在 0.68～5.44、0.143～1.144、0.0245～0.1960、0.088～0.704μg范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

表2 線(xiàn)性關(guān)系考察結(jié)果（n＝6）Tab 2Result of linear relationship（n＝6）

2.5 精密度試驗(yàn)

取同一混合對(duì)照品溶液（葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素的濃度分別為0.204、0.0429、0.00735、0.0264mg·mL－1）10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素峰面積的RSD分別為1.85%、2.33%、2.12%、1.67%（n均為6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液（河南產(chǎn)野葛）適量，分別于0、2、4、8、12h測(cè)定峰面積。結(jié)果，RSD＝0.936%（n＝5），表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一樣品（河南產(chǎn)野葛）適量，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，分別進(jìn)樣10μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄各成分峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算樣品中各成分的含量。結(jié)果，樣品中葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素的平均含量分別為 42.41、6.63、1.32、1.13mg·g－1，RSD 分別為 2.33%、2.41%、2.22%、2.36%（n均為6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素含量的樣品（河南產(chǎn)野葛）粉末0.1g，共6份，分別精密加入葛根素（0.46mg·mL－1）、大豆苷（0.72mg·mL－1）、大豆苷元（0.14mg·mL－1）對(duì)照品溶液10mL，染料木素（0.12mg·mL－1）對(duì)照品溶液1mL，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣10μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄各成分的峰面積，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 3Result of recovery test（n＝6）

2.9 樣品含量測(cè)定

取不同品種及不同產(chǎn)地的樣品，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣10μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄各成分的峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算樣品中各成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果（mg·g－1）Tab 4Results of content determination of sample（mg·g－1）

3 討論

從表4可知，廣西產(chǎn)粉葛各成分含量均低于其他2個(gè)品種，但由于其栽培產(chǎn)量高、藥材外形美觀(guān)，在市場(chǎng)份額上占有較大的比例，用量較大，在臨床應(yīng)用時(shí)有時(shí)代替野葛使用。

試驗(yàn)結(jié)果表明，河南產(chǎn)野葛的葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素含量均比山西、大別山產(chǎn)野葛的含量更高，說(shuō)明不同產(chǎn)地的環(huán)境、氣候、土壤、降水等條件對(duì)藥材有效成分的影響較大。故以后還將進(jìn)一步對(duì)不同地區(qū)、不同氣候條件的藥材進(jìn)行研究。

云南葛因其味苦，又稱(chēng)苦葛[2]，因其葛根素含量較高，在西南個(gè)別地區(qū)誤作葛根使用，被列為葛根的偽品之一。本試驗(yàn)結(jié)果也表明，云南葛中各成分含量相對(duì)較高。但因其有毒，只能作為農(nóng)藥、殺蟲(chóng)劑使用，不可作葛根入藥。

由于大豆苷元、大豆苷、葛根素、染料木素的極性不同，為保證各色譜峰具有良好的分離度，筆者試用甲醇-水（50∶50，V/V）等度洗脫，發(fā)現(xiàn)大豆苷、葛根素的出峰時(shí)間過(guò)早，保留時(shí)間分別為3、2min，分離度也較差；當(dāng)使用甲醇-水（30∶70，V/V）等度洗脫時(shí)，大豆苷元的出峰時(shí)間過(guò)晚，保留時(shí)間達(dá)51min；后采用甲醇-水梯度洗脫，4種成分均可達(dá)到基線(xiàn)分離，基線(xiàn)漂移幅度較小，峰形良好[11]。

在制備供試品溶液時(shí)，筆者分別考察了不同提取時(shí)間（20、30、40min）的提取效果。結(jié)果表明，4種成分的含量高低依次為提取40min＞30min＞20min，但提取40min的含量與提取30min較接近，故選擇30min為提取時(shí)間。

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Comparison of Puerarin，Daidzin，Daidzein，Genistein Content of Pueraria lobata，P.thomsonii and P.peduncularis

PEI Xiang-ping，LIU Ya-ming，LIU Ji-quan，LI Hui-feng，LI Jing（Shanxi University of Traditional Chinese Medicine，Taiyuan 030024，China）

OBJECTIVE：To compare the content of puerarin，daidzin，daidzein and genistein from Pueraria lobata，P.thomsonii and P.peduncularis.METHODS：After reflux extraction of 30%ethanol，the sample was determined by HPLC.The determination was performed on Uvis-201（250mm×4.6mm，5μm）column with mobile phase consisted of methanol-water（gradient elution）at the flow rate of 1.0mL·min－1.The detection wavelength was 250nm and column temperature was ambient temperature.RESULTS：The linear range was 0.68～5.44μg for puerarin（r＝0.9992），0.143～1.144μg for daidzin（r＝0.9993），0.0245～0.1960μg for daidzein（r＝0.9992）and 0.088～0.704μg（r＝0.9994）for genistein；average recovery rates were 98.1%，99.5%，101.1%and 99.2%，RSDs were 2.17%，2.42%，2.53%and 2.65%（n＝6）.The content of puerarin was in descending order：P.lobata in Henan＞P.peduncularis＞P.lobata in Shanxi＞P.lobata in Dabieshan＞P.thomsonii in Guangxi；the content of daidzin was in descending order：P.peduncularis＞P.lobata in Henan＞P.lobata in Dabieshan＞P.lobata in Shanxi＞P.thomsonii in Guangxi；the content of daidzein was in descending order：P.lobata in Henan＞P.peduncularis＞P.lobata in Shanxi＞P.lobata in Dabieshan＞P.thomsonii in Guangxi；the content of genistein was in descending order：P.lobata in Henan＞P.peduncularis＞P.lobata in Shanxi＞P.lobata in Dabieshan＞P.thomsonii in Guangxi.CONCLUSION：The contents of puerarin，daidzin，daidzein and genistein in P.lobata，P.thomsonii and P.peduncularis were different greatly，and P.peduncularis is a false one of P.lobata.The use of them should be different.

Pueraria lobata；Pueraria thomsonii；Pueraria peduncularis；Puerarin；Daidzin；Daidzein；Genistein；HPLC；Content；Comparison

R284.1；R927.2

A

1001-0408（2012）47-4462-03

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2012.47.18

Δ國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目資助課題（2011BA107B05）

＊副教授，碩士。研究方向：中藥鑒定、中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。E-mail：peixp69@163.com

#通訊作者：教授，碩士。研究方向：中藥資源、中藥藥效基礎(chǔ)。電話(huà)：0351-2272164。E-mail：liuyaming66@yahoo.com

2012-01-17

2012-03-22）