RP-HPLC法測(cè)定三皮止癬酊中蛇床子素的含量

鄒渭洪，付成效，龍宇，劉琪（.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科，湖南衡陽(yáng)400；.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥劑科，湖南衡陽(yáng) 400；.衡陽(yáng)市中醫(yī)院藥劑科，湖南衡陽(yáng) 400）

RP-HPLC法測(cè)定三皮止癬酊中蛇床子素的含量

鄒渭洪1＊，付成效1，龍宇2，劉琪3（1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科，湖南衡陽(yáng)421001；2.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥劑科，湖南衡陽(yáng) 421001；3.衡陽(yáng)市中醫(yī)院藥劑科，湖南衡陽(yáng) 421001）

目的：建立測(cè)定三皮止癬酊中蛇床子素含量的方法。方法：采用反相高效液相色譜法。色譜柱為Ultimate XB-C18（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇-水（76∶24，V/V），流速為1.0mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)為322nm，柱溫為25℃。結(jié)果：蛇床子素進(jìn)樣量在0.0384～0.7680μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系（r＝0.9996）；平均加樣回收率為100.45%，RSD＝1.88%（n＝6）。結(jié)論：本方法操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，適用于三皮止癬酊中蛇床子素的含量測(cè)定。

三皮止癬酊；反相高效液相色譜法；蛇床子素；含量測(cè)定

三皮止癬酊是由蛇床子、土荊皮、紫荊皮、苦樟根皮等中藥組方制成的制劑，具有清熱燥濕、殺蟲(chóng)止癢之功效，臨床上用于治療股癬、濕疹等癥。方中蛇床子為君藥，所含主要有效成分蛇床子素[1，2]具有抗變態(tài)反應(yīng)、增強(qiáng)免疫力的作用。其現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中只有常規(guī)檢查與薄層鑒別項(xiàng)，無(wú)定量控制指標(biāo)。因此，筆者采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法對(duì)三皮止癬酊中蛇床子素的含量測(cè)定方法進(jìn)行了研究，為該制劑的質(zhì)量控制提供定量檢測(cè)方法。

1 儀器與試藥

HP1100型HPLC儀，含HP1100色譜工作站、VWD紫外檢測(cè)器（美國(guó)惠普公司）；TG328A型萬(wàn)分之一光學(xué)讀數(shù)分析天平（南京東吳分析儀器有限公司）；超聲波清洗器（北京醫(yī)用設(shè)備廠）；HH-W型三用恒溫水浴鍋（上海印溪儀器儀表有限公司）。

蛇床子素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定用，批號(hào)：110822-200305）；三皮止癬酊（衡陽(yáng)市中醫(yī)院制劑室提供，批號(hào)：20110520、20110614、20110728，規(guī)格：100mL/瓶）；甲醇（色譜純，美國(guó)TEDIA天地試劑公司）；水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Ultimate XB-C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（76∶24，V/V）；流速：1.0mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng)：322nm；柱溫：25℃；靈敏度：2AUFS；進(jìn)樣量：10μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取蛇床子素對(duì)照品12.0mg，置25mL量瓶中，加無(wú)水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得480μg·mL－1的對(duì)照品貯備液；精密量取該貯備液1mL，置25mL量瓶中，加無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液（19.2μg·mL－1）。

2.2.2 供試品溶液 精密吸取本品10mL置錐形瓶中，蒸干，殘?jiān)尤?5mL乙酸乙酯，稱(chēng)重，超聲處理（功率：200W，頻率：40kHz）30min，放冷，再稱(chēng)重，用乙酸乙酯補(bǔ)足失重，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液5mL，蒸干，殘?jiān)尤脒m量無(wú)水乙醇溶解、轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按處方量并以相同工藝制備缺蛇床子藥材的陰性樣品，照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

在選定的色譜條件下，分別精密吸取對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液與供試品溶液各10μL，注入HPLC儀測(cè)定。結(jié)果，蛇床子素峰與樣品中其他組分峰可達(dá)基線分離，且與相鄰峰的分離度均＞1.5；理論板數(shù)按蛇床子素峰計(jì)算應(yīng)≥5000；陰性對(duì)照在與蛇床子素對(duì)照品色譜峰相應(yīng)位置處無(wú)干擾峰。色譜見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.蛇床子素對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照；1.蛇床子素Fig 1HPLC chromatogramsA.osthole control；B.test sample；C.negative control；1.osthole

2.4 線性關(guān)系考察

取蛇床子素對(duì)照品貯備液適量，加入無(wú)水乙醇依次稀釋成質(zhì)量濃度為3.84、9.60、19.20、28.80、38.40、76.80μg·mL－1的系列對(duì)照品溶液，分別精密吸取10μL注入HPLC儀，測(cè)定峰面積積分值。以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y＝2.971×103X+52.562（r＝0.9996，n＝6）。結(jié)果表明，蛇床子素進(jìn)樣量在0.0384～0.7680μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一對(duì)照品溶液10μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積積分值。結(jié)果，RSD＝1.01%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液10μL，于0、2、4、8、12、24、48h進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積積分值。結(jié)果，RSD＝1.35%（n＝7），表明供試品溶液在配制后48h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批（批號(hào)：20110520）樣品適量，共6份，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算蛇床子素的含量。結(jié)果，RSD＝1.08%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密吸取已知含量（0.1027mg·mL－1）的樣品10mL，共6份，分別加入一定量的蛇床子素對(duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照上述方法測(cè)定樣品含量并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.9 樣品含量測(cè)定

取3批樣品各適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樣品中蛇床子素的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

在供試品溶液的制備過(guò)程中，先將樣品直接用無(wú)水乙醇稀釋至一定濃度后進(jìn)樣，色譜圖上基線不平穩(wěn)，蛇床子素峰有干擾，出現(xiàn)肩峰；即使通過(guò)改變流動(dòng)相比例，也未能有效分離?？紤]到該制劑藥味組成較多，且酊劑以乙醇為溶媒，含有成分復(fù)雜，故根據(jù)蛇床子素在乙酸乙酯中溶解性好的特點(diǎn)，先將樣品蒸干，再用乙酸乙酯超聲提取，這樣就除去了一部分水溶性雜質(zhì)和干擾成分，色譜圖上基線不會(huì)出現(xiàn)抬高飄移的現(xiàn)象，蛇床子素出峰良好。

本試驗(yàn)考察了乙酸乙酯超聲提取15、30、45min對(duì)蛇床子素含量測(cè)定的影響。結(jié)果表明，樣品在超聲提取30min時(shí)已基本提取完全，因此采用超聲法提取30min。

參照《中國(guó)藥典》[3]和有關(guān)文獻(xiàn)[4～8]對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)不需加入酸液或緩沖液即可獲得良好的色譜峰；因甲醇相對(duì)乙腈毒性較小，價(jià)格也低廉，故選擇甲醇-水（76∶24，V/V）作為本試驗(yàn)流動(dòng)相。

綜上，本方法操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，適用于三皮止癬酊中蛇床子素的含量測(cè)定。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1Recovery of recovery tests（n＝6）

表2 三皮止癬酊中蛇床子素的含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab 2Content determination of osthole in Sanpi zhixuan tincture（n＝3）

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Content Determination of Osthole in Sanpi Zhixuan Tincture by RP-HPLC

ZOU Wei-hong，F(xiàn)U Cheng-xiao（Dept.of Pharmacy，The First Affiliated Hospital of Nanhua University，Hunan Hengyang 421001，China）
LONG Yu（Dept.of Pharmacy，The Second Affiliated Hospital of Nanhua University，Hunan Hengyang 421001，China）
LIU Qi（Dept.of Pharmacy，Hengyang Hospital of Traditional Chinese Medicine，Hunan Hengyang 421001，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the content determination of osthole in Sanpi zhixuan tincture.METHODS：RP-HPLC method was adopted.The determination was performed on Ultimate XB-C18（250mm×4.6mm，5μm）column with mobile phase consisted of methanol-water（76∶24，V/V）at the flow rate of 1.0mL·min－1.The detection wavelength was set at 322nm and column temperature was 25℃.RESULTS：The linear range of osthole was 0.0384～0.7680μg（r＝0.9996）with an average recovery of 100.45%（RSD＝1.88%，n＝6）.CONCLUSION：The method is simple，rapid，accurate and suitable for the content determination of osthole in Sanpi zhixuan tincture.

Sanpi zhixuan tincture；RP-HPLC；Osthole；Content determination

R283.662；R927.2

A

1001-0408（2012）47-4484-02

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2012.47.26

＊副主任藥師。研究方向：臨床藥學(xué)與中藥質(zhì)量控制。電話：0734-8279115。E-mail：nhfyzwh@163.com

2012-08-30

2012-10-30）