頭針對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦微血管Ⅳ型膠原蛋白影響的動(dòng)態(tài)研究*

于學(xué)平，孫曉偉，鄒 偉

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150040)

近年來腦缺血再灌注過程中血腦屏障(bloodbrain barrier，BBB)破壞已成為缺血再灌注損傷研究的一個(gè)熱點(diǎn)。腦微血管基底膜是BBB的重要結(jié)構(gòu)之一，當(dāng)BBB的結(jié)構(gòu)或功能的完整性損傷、通透性增強(qiáng)時(shí)，往往以微血管基底膜損傷最為重要。頭針作為治療缺血性腦血管病的一種有效方法，其對(duì)腦缺血再灌注后BBB保護(hù)作用方面的研究甚少，而有關(guān)腦微血管基底膜中Ⅳ型膠原蛋白的相關(guān)研究更是未見報(bào)道，因此，本研究通過腦缺血再灌注大鼠模型，觀察頭針干預(yù)后不同時(shí)間點(diǎn)腦微血管基底膜Ⅳ型膠原蛋白的動(dòng)態(tài)變化，以明確頭針治療腦缺血再灌注損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組

選取SD健康雄性大鼠130只(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供)，體重280～300 g。隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和針刺組。假手術(shù)組30只大鼠，其余兩組每組再隨機(jī)分為 MCAO2h/R4h、MCAO2h/R12h、MCAO2h/R24h、MCAO2h/R48h 和 MCAO2h/R72h等5個(gè)亞組，每個(gè)亞組10只大鼠，其中5只用來做免疫組化檢測(cè)，5只用來做ELISA檢測(cè)。

1.2 模型制備

參照改良的Zea Longa線栓法，制成大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血2 h再灌注模型(MCAO/R)。術(shù)后大鼠左側(cè)肢體偏癱:提尾懸空時(shí)左上肢不能伸展或行進(jìn)時(shí)向左側(cè)傾倒、向左側(cè)旋轉(zhuǎn)，表明造模成功。

1.3 干預(yù)方法

針刺組從百會(huì)穴進(jìn)針，刺向右側(cè)曲鬢穴，進(jìn)針約0.8寸，以200 r/min速度捻轉(zhuǎn)5 min，留針30 min，期間捻轉(zhuǎn)2次。假手術(shù)組和模型組大鼠，每天在針刺組治療時(shí)間內(nèi)，均要抓取并固定1次，每次30 min，以保證與針刺組大鼠具有相同的飼養(yǎng)條件。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 Ⅳ型膠原免疫組化測(cè)定 在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)灌注處死大鼠，斷頭取腦，石蠟包埋。腦組織石蠟切片經(jīng)脫臘、水化，3%H2O2抑制內(nèi)原性過氧化物酶，1%牛血清白蛋白封閉，滴加ColIV一抗，4℃過夜。滴加生物素標(biāo)記的二抗，37℃溫育30 min。滴加過氧化酶－鏈霉卵白素，37℃溫育30 min。DAB顯色液顯色。蘇木素復(fù)染、封片。

1.4.2 Ⅳ型膠原ELISA測(cè)定 在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，迅速斷頭取腦。將腦組織在冰浴中勻漿，提取蛋白。ELISA法檢測(cè)腦組織中Ⅳ型膠原含量的操作，嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05說明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠缺血側(cè)腦組織Ⅳ型膠原免疫組化染色結(jié)果

在光學(xué)顯微鏡下，Ⅳ型膠原蛋白在各組大鼠腦組織中主要沿血管內(nèi)壁呈陽性表達(dá)。假手術(shù)組:Ⅳ型膠原的表達(dá)豐富、連續(xù)，可見沿毛細(xì)血管內(nèi)壁一周強(qiáng)陽性染色，在大血管中更為明顯。模型組:可見梗死灶周圍區(qū)的Ⅳ型膠原表達(dá)，與假手術(shù)組比較明顯減弱。再灌注4 h時(shí)血管扭曲變形，但Ⅳ型膠原沿血管的表達(dá)仍呈連續(xù)狀態(tài);再灌注12 h，Ⅳ型膠原的表達(dá)明顯減弱，沿血管呈間斷表達(dá);再灌注24～48 h，Ⅳ型膠原的表達(dá)降低最為顯著，僅沿血管呈少量散在點(diǎn)狀陽性染色;72 h組Ⅳ型膠原的表達(dá)量開始增加，連續(xù)表達(dá)與間斷表達(dá)Ⅳ型膠原的血管并存。頭針組大鼠在再灌注4 h、12 h梗死灶周圍區(qū)的Ⅳ型膠原表達(dá)與模型組相似;隨著針刺時(shí)間的延長和針刺次數(shù)的增加，再灌注24 h、48 h、72 h與模型組相比，梗死灶周圍區(qū)Ⅳ型膠原表達(dá)有所增加，但仍低于假手術(shù)組表達(dá)。

2.2 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠缺血側(cè)腦組織Ⅳ型膠原蛋白表達(dá)的ELISA檢測(cè)結(jié)果

表1 3組大鼠缺血側(cè)腦微血管Ⅳ型膠原蛋白表達(dá)含量比較(±s)

表1 3組大鼠缺血側(cè)腦微血管Ⅳ型膠原蛋白表達(dá)含量比較(±s)

注:與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組比較，△P＜0.05;與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)模型組比較，★P＜0.05。

IR4h IR12h IR24h IR48h IR72h假手術(shù)組 3 0.97 ±0.04 0.92 ±0.03 0.90 ±0.04 0.90 ±0.03 0.組別 例數(shù)94 ±0.02模型組 5 0.86 ±0.02△ 0.79 ±0.04△ 0.53 ±0.01△ 0.49 ±0.02△ 0.59 ±0.02△針刺組 5 0.88 ±0.01△ 0.81 ±0.02△ 0.65 ±0.02△★ 0.58 ±0.02△★ 0.69 ±0.01△★

由表1可看出，大鼠腦缺血再灌注后的不同時(shí)間點(diǎn)缺血側(cè)腦微血管Ⅳ型膠原蛋白含量:模型組、頭針組均較假手術(shù)組明顯減低，具有顯著性差異(P＜0.05)。模型組大鼠在再灌注后4 h，缺血側(cè)腦組織中Ⅳ型膠原蛋白含量即明顯減低;且持續(xù)減少，至再灌注24～48 h，水平最低;隨后其含量開始升高，再灌注后72 h，其含量為0.59±0.02，但仍明顯低于假手術(shù)組(P＜0.05)。針刺組與模型組比較，頭針組大鼠在再灌注后各時(shí)間點(diǎn)缺血側(cè)腦組織中Ⅳ型膠原蛋白含量均有所升高，并逐漸增加，至再灌注后24 h、48 h、72 h升高最為明顯，與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的模型組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

3 討論

血腦屏障(BBB)是位于腦組織與血液之間的一個(gè)屏障結(jié)構(gòu)，主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞及其緊密連接(TJ)、血管基底膜和星形膠質(zhì)細(xì)胞終足組成。腦缺血再灌注損傷可引起B(yǎng)BB破壞，而BBB破壞是導(dǎo)致缺血再灌注后腦水腫和炎癥反應(yīng)等病理變化的重要環(huán)節(jié)[1]?；啄ぷ鳛槊?xì)血管的支持結(jié)構(gòu)，Ⅳ型膠原(ColIV)和層連蛋白(LN)是基底膜的主要成分，在這一病理過程中尤為重要。Hamann等發(fā)現(xiàn)局部腦缺血再灌注24 h后，腦微血管基底膜層連蛋白、纖維連接蛋白、Ⅳ型膠原等表達(dá)均明顯減少，基底膜抗原也同步消失，說明腦缺血再灌注后存在腦微血管基底膜損害[2]。李玲等通過觀察腦缺血再灌注損傷過程中基底膜的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)再灌注12 h至3天時(shí)，腦水腫和腦出血最為嚴(yán)重;再灌注12 h至7天，腦微血管基底膜大片脫落、溶解、缺損，Ⅳ型膠原與層連蛋白抗原明顯減少至消失，并與腦水腫、出血部位相一致。認(rèn)為基底膜破壞的根本原因是Ⅳ型膠原、層連蛋白等成分的減少[3]?？梢姠粜湍z原作為構(gòu)成微血管基底膜的主要物質(zhì)之一，是維持BBB完整性的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，尋求其有效的干預(yù)方法，對(duì)腦缺血再灌注損傷的防治將具有重要的臨床價(jià)值。

本研究采用改良的Zea Longa線栓法制備腦缺血/再灌注(MCAO/R)模型，運(yùn)用免疫組化與 ELISA檢測(cè)方法，從蛋白定性及定量的不同角度，檢測(cè)缺血再灌注后不同時(shí)相點(diǎn)MCAO/R模型大鼠梗死區(qū)血管內(nèi)壁Ⅳ型膠原陽性細(xì)胞表達(dá)的情況，兩種方法得出結(jié)論是一致的:缺血側(cè)腦組織中Ⅳ型膠原含量于再灌注4 h即開始減低，12 h明顯降低，24 h～48 h時(shí)降解達(dá)到高峰，隨后有所增加，此結(jié)果與筆者前期相關(guān)研究中所觀察到的腦梗死體積、腦水含量、BBB結(jié)構(gòu)和通透性以及 MMP －9 的動(dòng)態(tài)變化相一致[4～5]，從而證明了Ⅳ型膠原蛋白表達(dá)的減少與腦缺血再灌注后BBB的破壞和繼發(fā)性腦損害密切相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)針刺組大鼠再灌注后各時(shí)間點(diǎn)梗死灶周圍區(qū)Ⅳ型膠原的表達(dá)均較模型組增加;于再灌注后24 h、48 h、72 h，Ⅳ型膠原蛋白表達(dá)加強(qiáng)最為明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。此結(jié)果與前期有關(guān)針刺與腦水含量及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白酶MMP－9的研究結(jié)果相吻合:針刺組大鼠在再灌注24 h、48 h、72 h，腦組織水含量較模型組顯著降低;再灌注各時(shí)間點(diǎn)頭針組大鼠缺血側(cè)腦組織 MMP－9表達(dá)較模型組顯著減少[4～5]。從而得出結(jié)論:早期進(jìn)行頭針干預(yù)治療能上調(diào)缺血側(cè)腦組織中Ⅳ型膠原蛋白的表達(dá)，并隨著針刺治療時(shí)間的延長，其效果明顯提高，其機(jī)理可能與下調(diào)內(nèi)源性MMP－9表達(dá)，減輕其對(duì)Ⅳ型膠原蛋白的降解有關(guān)。說明上調(diào)Ⅳ型膠原蛋白的表達(dá)，加強(qiáng)毛細(xì)血管基底膜的支持作用，保護(hù)BBB的完整性，可能是頭針治療腦缺血再灌注損傷的作用機(jī)制之一。

[1]海艦，丁美修.腦缺血再灌注時(shí)血腦屏障損傷的炎性機(jī)制[J].國外醫(yī)學(xué)·腦血管疾病分冊(cè)，2001，9(1):15－18

[2]Hamann GF，Okada Y，F(xiàn)itridge R，et al.Microvascular basal lamina antigens disappear during cerebral ischemia and reperfusion[J].Stroke，1995，26:2120 －2126

[3]李玲，黃如訓(xùn)，張小燕，等.局部腦缺血再灌注病灶區(qū)腦微血管基底膜及其成分改變的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華老年醫(yī)學(xué)雜志，2000，19(5):364－367

[4]孫曉偉，于學(xué)平，于春林，等.頭針對(duì)腦缺血再灌注大鼠血腦屏障影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].針灸臨床雜志，2011，27(6):66 －69

[5]孫曉偉，于學(xué)平，李洪濤，等.頭針對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦組織MMP－9表達(dá)調(diào)控的動(dòng)態(tài)研究[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2011，39(3):107－110