于學平,孫曉偉,鄒 偉
(黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院,黑龍江哈爾濱150040)
近年來腦缺血再灌注過程中血腦屏障(bloodbrain barrier,BBB)破壞已成為缺血再灌注損傷研究的一個熱點。腦微血管基底膜是BBB的重要結構之一,當BBB的結構或功能的完整性損傷、通透性增強時,往往以微血管基底膜損傷最為重要。頭針作為治療缺血性腦血管病的一種有效方法,其對腦缺血再灌注后BBB保護作用方面的研究甚少,而有關腦微血管基底膜中Ⅳ型膠原蛋白的相關研究更是未見報道,因此,本研究通過腦缺血再灌注大鼠模型,觀察頭針干預后不同時間點腦微血管基底膜Ⅳ型膠原蛋白的動態(tài)變化,以明確頭針治療腦缺血再灌注損傷的作用機制。
選取SD健康雄性大鼠130只(北京維通利華實驗動物技術有限公司提供),體重280~300 g。隨機分為假手術組、模型組和針刺組。假手術組30只大鼠,其余兩組每組再隨機分為 MCAO2h/R4h、MCAO2h/R12h、MCAO2h/R24h、MCAO2h/R48h 和 MCAO2h/R72h等5個亞組,每個亞組10只大鼠,其中5只用來做免疫組化檢測,5只用來做ELISA檢測。
參照改良的Zea Longa線栓法,制成大鼠右側大腦中動脈缺血2 h再灌注模型(MCAO/R)。術后大鼠左側肢體偏癱:提尾懸空時左上肢不能伸展或行進時向左側傾倒、向左側旋轉,表明造模成功。
針刺組從百會穴進針,刺向右側曲鬢穴,進針約0.8寸,以200 r/min速度捻轉5 min,留針30 min,期間捻轉2次。假手術組和模型組大鼠,每天在針刺組治療時間內,均要抓取并固定1次,每次30 min,以保證與針刺組大鼠具有相同的飼養(yǎng)條件。
1.4.1 Ⅳ型膠原免疫組化測定 在相應時間點灌注處死大鼠,斷頭取腦,石蠟包埋。腦組織石蠟切片經脫臘、水化,3%H2O2抑制內原性過氧化物酶,1%牛血清白蛋白封閉,滴加ColIV一抗,4℃過夜。滴加生物素標記的二抗,37℃溫育30 min。滴加過氧化酶-鏈霉卵白素,37℃溫育30 min。DAB顯色液顯色。蘇木素復染、封片。
1.4.2 Ⅳ型膠原ELISA測定 在相應時間點處死大鼠,迅速斷頭取腦。將腦組織在冰浴中勻漿,提取蛋白。ELISA法檢測腦組織中Ⅳ型膠原含量的操作,嚴格按照試劑盒說明進行。
運用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數據處理,計量資料以均數±標準差(±s)表示,組間比較采用方差分析,P<0.05說明差異有統(tǒng)計學意義。
在光學顯微鏡下,Ⅳ型膠原蛋白在各組大鼠腦組織中主要沿血管內壁呈陽性表達。假手術組:Ⅳ型膠原的表達豐富、連續(xù),可見沿毛細血管內壁一周強陽性染色,在大血管中更為明顯。模型組:可見梗死灶周圍區(qū)的Ⅳ型膠原表達,與假手術組比較明顯減弱。再灌注4 h時血管扭曲變形,但Ⅳ型膠原沿血管的表達仍呈連續(xù)狀態(tài);再灌注12 h,Ⅳ型膠原的表達明顯減弱,沿血管呈間斷表達;再灌注24~48 h,Ⅳ型膠原的表達降低最為顯著,僅沿血管呈少量散在點狀陽性染色;72 h組Ⅳ型膠原的表達量開始增加,連續(xù)表達與間斷表達Ⅳ型膠原的血管并存。頭針組大鼠在再灌注4 h、12 h梗死灶周圍區(qū)的Ⅳ型膠原表達與模型組相似;隨著針刺時間的延長和針刺次數的增加,再灌注24 h、48 h、72 h與模型組相比,梗死灶周圍區(qū)Ⅳ型膠原表達有所增加,但仍低于假手術組表達。
表1 3組大鼠缺血側腦微血管Ⅳ型膠原蛋白表達含量比較(±s)
表1 3組大鼠缺血側腦微血管Ⅳ型膠原蛋白表達含量比較(±s)
注:與相應時間點假手術組比較,△P<0.05;與相應時間點模型組比較,★P<0.05。
IR4h IR12h IR24h IR48h IR72h假手術組 3 0.97 ±0.04 0.92 ±0.03 0.90 ±0.04 0.90 ±0.03 0.組別 例數94 ±0.02模型組 5 0.86 ±0.02△ 0.79 ±0.04△ 0.53 ±0.01△ 0.49 ±0.02△ 0.59 ±0.02△針刺組 5 0.88 ±0.01△ 0.81 ±0.02△ 0.65 ±0.02△★ 0.58 ±0.02△★ 0.69 ±0.01△★
由表1可看出,大鼠腦缺血再灌注后的不同時間點缺血側腦微血管Ⅳ型膠原蛋白含量:模型組、頭針組均較假手術組明顯減低,具有顯著性差異(P<0.05)。模型組大鼠在再灌注后4 h,缺血側腦組織中Ⅳ型膠原蛋白含量即明顯減低;且持續(xù)減少,至再灌注24~48 h,水平最低;隨后其含量開始升高,再灌注后72 h,其含量為0.59±0.02,但仍明顯低于假手術組(P<0.05)。針刺組與模型組比較,頭針組大鼠在再灌注后各時間點缺血側腦組織中Ⅳ型膠原蛋白含量均有所升高,并逐漸增加,至再灌注后24 h、48 h、72 h升高最為明顯,與相應時間點的模型組相比,具有統(tǒng)計學意義(P <0.05)。
血腦屏障(BBB)是位于腦組織與血液之間的一個屏障結構,主要由血管內皮細胞及其緊密連接(TJ)、血管基底膜和星形膠質細胞終足組成。腦缺血再灌注損傷可引起B(yǎng)BB破壞,而BBB破壞是導致缺血再灌注后腦水腫和炎癥反應等病理變化的重要環(huán)節(jié)[1]?;啄ぷ鳛槊氀艿闹С纸Y構,Ⅳ型膠原(ColIV)和層連蛋白(LN)是基底膜的主要成分,在這一病理過程中尤為重要。Hamann等發(fā)現局部腦缺血再灌注24 h后,腦微血管基底膜層連蛋白、纖維連接蛋白、Ⅳ型膠原等表達均明顯減少,基底膜抗原也同步消失,說明腦缺血再灌注后存在腦微血管基底膜損害[2]。李玲等通過觀察腦缺血再灌注損傷過程中基底膜的動態(tài)變化,發(fā)現再灌注12 h至3天時,腦水腫和腦出血最為嚴重;再灌注12 h至7天,腦微血管基底膜大片脫落、溶解、缺損,Ⅳ型膠原與層連蛋白抗原明顯減少至消失,并與腦水腫、出血部位相一致。認為基底膜破壞的根本原因是Ⅳ型膠原、層連蛋白等成分的減少[3]??梢姠粜湍z原作為構成微血管基底膜的主要物質之一,是維持BBB完整性的重要結構基礎,尋求其有效的干預方法,對腦缺血再灌注損傷的防治將具有重要的臨床價值。
本研究采用改良的Zea Longa線栓法制備腦缺血/再灌注(MCAO/R)模型,運用免疫組化與 ELISA檢測方法,從蛋白定性及定量的不同角度,檢測缺血再灌注后不同時相點MCAO/R模型大鼠梗死區(qū)血管內壁Ⅳ型膠原陽性細胞表達的情況,兩種方法得出結論是一致的:缺血側腦組織中Ⅳ型膠原含量于再灌注4 h即開始減低,12 h明顯降低,24 h~48 h時降解達到高峰,隨后有所增加,此結果與筆者前期相關研究中所觀察到的腦梗死體積、腦水含量、BBB結構和通透性以及 MMP -9 的動態(tài)變化相一致[4~5],從而證明了Ⅳ型膠原蛋白表達的減少與腦缺血再灌注后BBB的破壞和繼發(fā)性腦損害密切相關。
本研究發(fā)現針刺組大鼠再灌注后各時間點梗死灶周圍區(qū)Ⅳ型膠原的表達均較模型組增加;于再灌注后24 h、48 h、72 h,Ⅳ型膠原蛋白表達加強最為明顯,具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。此結果與前期有關針刺與腦水含量及細胞外基質蛋白酶MMP-9的研究結果相吻合:針刺組大鼠在再灌注24 h、48 h、72 h,腦組織水含量較模型組顯著降低;再灌注各時間點頭針組大鼠缺血側腦組織 MMP-9表達較模型組顯著減少[4~5]。從而得出結論:早期進行頭針干預治療能上調缺血側腦組織中Ⅳ型膠原蛋白的表達,并隨著針刺治療時間的延長,其效果明顯提高,其機理可能與下調內源性MMP-9表達,減輕其對Ⅳ型膠原蛋白的降解有關。說明上調Ⅳ型膠原蛋白的表達,加強毛細血管基底膜的支持作用,保護BBB的完整性,可能是頭針治療腦缺血再灌注損傷的作用機制之一。
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[3]李玲,黃如訓,張小燕,等.局部腦缺血再灌注病灶區(qū)腦微血管基底膜及其成分改變的實驗研究[J].中華老年醫(yī)學雜志,2000,19(5):364-367
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[5]孫曉偉,于學平,李洪濤,等.頭針對腦缺血再灌注大鼠腦組織MMP-9表達調控的動態(tài)研究[J].中醫(yī)藥學報,2011,39(3):107-110