HPV16／18感染、細(xì)胞增殖及凋亡在尖銳濕疣復(fù)發(fā)中的作用

吳 迪，吳 嚴(yán)，張曉冬

（1.北華大學(xué)附屬醫(yī)院 皮膚科，吉林 吉林132013；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬一院 皮膚科，遼寧 沈陽110001）

尖銳濕疣（condylomata acuminate，CA）是由人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染引起的一種以乳頭瘤樣增生性為特征的疾病，易于復(fù)發(fā)。與CA密切相關(guān)的 HPV主要有6、11、16、18型，其中 HPV6、11為低危型病毒，多見于良性病變，而HPV16、18型為高危型病毒，多存在于宮頸癌等惡性腫瘤中。有研究應(yīng)用免疫組化方法和蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測到CA組織中細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶及增殖性核抗原表達(dá)增強(qiáng)［1］；亦有研究采用原位特異性DNA片斷標(biāo)記法及免疫組化方法檢測到CA皮損中角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞凋亡及與凋亡正相關(guān)的caspase－3表達(dá)顯著增加［2］。因此，CA的發(fā)病除與HPV感染有關(guān)，還與細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡紊亂密切相關(guān)。

本研究采用熒光定量PCR及流式細(xì)胞儀對(duì)復(fù)發(fā)型CA皮損進(jìn)行HPV16／18、細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡檢測，以探討CA的復(fù)發(fā)機(jī)制及癌變潛在性。

1 材料與方法

1.1 CA病例 所有患者均來自我院皮膚性病科門診，經(jīng)臨床及／或病理明確診斷為CA，均為復(fù)發(fā)病例。共63例，其中男性37例，女性26例；年齡18～56歲，平均23.93±7.45歲；病程2個(gè)月～35個(gè)月，平均5.19±2.13月。

1.2 分組 按疾病復(fù)發(fā)病史遷延時(shí)間，將CA患者分為3組：A組為3個(gè)月以內(nèi)，共23例；B組為3個(gè)月～6個(gè)月，共25例；C組為6個(gè)月以上，共15例。另取包皮環(huán)切術(shù)包皮組織做為對(duì)照組，共10例

1.3 CA患者標(biāo)本采集 用生理鹽水浸潤的無菌棉簽用力反復(fù)擦拭疣體表面3次，將棉簽放入裝有1ml生理鹽水的無菌試管中。疣體常規(guī)碘伏消毒，2%利多卡因局部浸潤麻醉，以齒鑷夾住疣體，用多功能電離子手術(shù)治療機(jī)（GX－3，廣西科學(xué)院應(yīng)用物理研究所）燒灼皮損根部，取下組織塊，放入裝有足量生理鹽水的試管中。

1.4 熒光定量PCR檢測 貼試管壁擠出取樣后棉簽中的液體，棄棉簽，取100μl待測液體，13 000 rpm離心10min，棄上清，PCR樣品處理管中加入50μl樣品裂解液充分振蕩混勻，100℃煮沸10min，13 000rpm離心10min，取上清2μl作為反應(yīng)模板。按HPV16／18型核酸擴(kuò)增熒光檢測試劑盒（深圳匹基生物工程公司）進(jìn)行PCR基因擴(kuò)增。循環(huán)參數(shù)：預(yù)變性為93℃5min，PCR循環(huán)為37℃3min、93℃1min、93℃5min、60℃40min，共循環(huán)43次。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測 將疣體組織塊剪碎研磨，濾紙過濾，1 000rpm離心5min，棄上清，用磷酸鹽緩沖液4ml漂洗，1 000rpm離心5min，棄上清，碘化丙啶染色半小時(shí)，上機(jī)（EPICS XL流式細(xì)胞儀，美國貝克曼公司）檢測S期細(xì)胞百分率和凋亡細(xì)胞BAD值。

1.6 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 14.0軟件包進(jìn)行處理。等級(jí)資料采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，計(jì)量資料中的偏態(tài)分布資料采用非參數(shù)檢驗(yàn)、正態(tài)分布資料采用方差分析，各指標(biāo)相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV16／18檢測 對(duì)照組和CA組 HPV16／18陽性檢出率分別為0%和6.4%，二者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0.63，P＞0.05）。CA 組中，C組陽性率最高，三組間有顯著差異（χ2＝6.492，P＜0.05）。

2.2 S期細(xì)胞百分率 對(duì)照組和CA組S期細(xì)胞百分率分別為2.01%和6.22%，前者顯著低于后者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z＝4.829，P＜0.05）。CA組中，A組最低、C組最高。三組間兩兩相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝43.80，P＜0.05）。B組中的1例及C組中3例HPV16／18陽性者S期細(xì)胞百分率分別為8.97%及9.34%～10.15%。HPV16／18陽性CA患者S期細(xì)胞百分率（9.28%）明顯高于陰性患者（5.95%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z＝3.270，P＜0.05）。

2.3 凋亡細(xì)胞BAD值百分率 對(duì)照組和CA組BAD值百分率分別為5.09%和52.48%，前者顯著低于后者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z＝5.054，P＜0.05）。CA組中，A組最高、C組最低。三組間兩兩相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝1471.09，P＜0.05）。B組中的1例及C組中3例HPV16／18陽性者BAD百分率分別為42.60%及36.58～37.4%。HPV16／18陽性CA患者BAD百分率（38.44%）明顯低于陰性患者（53.70%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z＝2.946，P＜0.05）。

表1 CA復(fù)發(fā)患者及對(duì)照組三項(xiàng)指標(biāo)檢測結(jié)果

2.4 CA患者各指標(biāo)相關(guān)性 所有CA患者HPV16／18陽性率與S期細(xì)胞百分率呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.415（P＜0.05）；與凋亡細(xì)胞BAD值百分率呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為－0.374（P＜0.05）。其中，C組患者HPV16／18與S期細(xì)胞百分率相關(guān)系數(shù)為0.656（P＜0.05）、與凋亡細(xì)胞BAD值百分率相關(guān)系數(shù)為－0.677（P＜0.05）。所有CA患者S期細(xì)胞百分率與凋亡細(xì)胞BAD值百分率呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為－0.762（P＜0.05）；其中，A組患者相關(guān)系數(shù)為－0.313（P＞0.05）、B組為－0.226（P＞0.05）、C組為－0.519（P＜0.05），即C組相關(guān)性最大，且僅C組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

本研究中，對(duì)照組及CA復(fù)發(fā)3個(gè)月以內(nèi)者均未檢出HPV16／18，CA復(fù)發(fā)3個(gè)月～6個(gè)月者25例中有1例檢出，而復(fù)發(fā)6個(gè)月以上者僅15個(gè)人即檢出3例，出現(xiàn)了病程越長HPV16／18檢出率越高的趨勢，由于HPV16／18為高危型病毒，復(fù)發(fā)次數(shù)越多、病程越長則發(fā)生癌變可能性越大。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，HPV16／18陽性率與代表細(xì)胞增殖的S期細(xì)胞百分比呈顯著正相關(guān)，而與代表細(xì)胞凋亡的BAD值百分率呈顯著負(fù)相關(guān)，且復(fù)發(fā)6個(gè)月以上者相關(guān)性最大。另外，HPV16／18陽性者S期細(xì)胞百分比顯著高于、BAD值百分率顯著低于HPV陰性者。提示HPV16／18感染、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡三者在CA復(fù)發(fā)乃至癌變起相互聯(lián)系發(fā)揮作用。

CA患者疣體組織細(xì)胞增生程度及凋亡細(xì)胞百分比均比正常人顯著增高，提示當(dāng)CA患者HPV感染后，疣體組織細(xì)胞增殖與凋亡均增強(qiáng)。正常狀態(tài)下，細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡是一對(duì)并存的矛盾，二者維持動(dòng)態(tài)平衡。CA在臨床上表現(xiàn)為增殖反應(yīng)，同時(shí)伴有增高的細(xì)胞凋亡，后者可限制其發(fā)生癌變；但如果組織過度增殖而抑制細(xì)胞凋亡時(shí)則可能導(dǎo)致CA組織癌變。本研究中，病情反復(fù)發(fā)作長達(dá)6個(gè)月以上者S期細(xì)胞百分比顯著高于病程短者，而凋亡細(xì)胞BAD值百分比顯著低于病程短者，且其HPV16／18陽性率顯著增高，均提示此部分患者存在潛在癌變的可能性。

CA患者疣體組織中存在增強(qiáng)的細(xì)胞凋亡，是由于病毒感染能直接誘導(dǎo)凋亡［3］。HPV感染后細(xì)胞凋亡增加可能起到平衡疣體組織過度增生和調(diào)節(jié)表皮細(xì)胞過度分化的重要作用［4］。同時(shí)，CA疣體組織中凋亡在限制病毒的繁殖上也起了重要作用，因?yàn)楸砥ぜ?xì)胞適度的出現(xiàn)凋亡，在某種程度上自動(dòng)控制了病毒在細(xì)胞內(nèi)不斷增長和擴(kuò)散［5］。臨床上，某些CA患者疣體可長時(shí)間保持穩(wěn)定，不再繼續(xù)增長，少數(shù)疣體可自行消退，而且外陰CA患者癌變率底，可能均與CA疣體組織中細(xì)胞凋亡增強(qiáng)有關(guān)。

綜上，與對(duì)照組織相比，CA組織的細(xì)胞增殖和凋亡均明顯增強(qiáng)；與病程較短者相比，病程遷延時(shí)間越長，CA組織中HPV16／18感染參與的可能性越大，細(xì)胞增殖越明顯，細(xì)胞凋亡則減弱，疣體組織癌變潛在危險(xiǎn)因素增加。探討HPV16／18、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡有CA復(fù)發(fā)中的作用，有助于了解CA的發(fā)病及復(fù)發(fā)機(jī)制，為臨床治療及預(yù)防復(fù)發(fā)提供有益的思路。

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［2］熊 芬，項(xiàng) 彤，眭維恥.尖銳濕疣細(xì)胞凋亡與caspa se－3、bc1－2的表達(dá)［J］.皮膚病與性病，2006，28（4）：4.

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［4］Isaccon C，Kessis TD，Hedrick L，et al.Both cell proliferation and apoptosis increases with lesion grade in cervical neoplasia but not correlate with human papillomavirus type［J］.Cancer res，1996，56：669.

［5］Tsaceson C，Kessis TD，et al.Both cell proliferation and apoptosis increase with lesion grade in cervical neoplasia but not correlate with human papillomavirus type［J］.Cancer res，1996，56（4）：669.