慢性乙型肝炎病毒感染者乙肝病毒大蛋白檢測的臨床意義

王建華，王衛(wèi)國，馬黎麗，王 偉，化術(shù)靜，張紅安

（阜陽市人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，安徽 阜陽236004）

乙型肝炎病毒（HBV）是世界上危害公眾健康的最大的感染性因子之一，而我國是乙型肝炎的高發(fā)區(qū)，人群中乙型肝炎病毒的攜帶率約10.3%左右，慢性乙型肝炎患者約3000萬人［1］。目前臨床對HBV感染患者，通常使用血清學(xué)指標(biāo)（乙肝二對半）、HBV－DNA和肝功能檢測，來反映患者病毒是否復(fù)制及抗病毒治療療效觀察。由于e抗原敏感性較差以及HBV－DNA檢測要求較高，臨床需要一種操作簡單易行并且較為敏感的指標(biāo)來反映病毒復(fù)制。HBV－LP是一種包含PreS1、PreS2和HBsAg的病毒包膜蛋白，具有復(fù)雜的跨膜構(gòu)象拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，參與HBV的吸附、包膜化、組裝、成熟等過程，并與肝細(xì)胞纖維化、肝癌及丁型肝炎的發(fā)生有關(guān)［2－5］。本實(shí)驗(yàn)通過檢測慢性HBV感染者HBV－LP、PreS1Ag、PreS2Ag、HBV－DNA 及肝功能，探討 HBV－LP的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇收集2009年10月至2011年2月于阜陽市人民醫(yī)院就診的180例慢性HBV感染者，診斷標(biāo)準(zhǔn)符合第十次全國傳染病與寄生蟲病學(xué)會和肝病學(xué)分會聯(lián)合修訂的病毒性肝炎防治方案，其中 HBV－DNA陽性患者130例，其中男84例，女46例，年齡9～77歲，HBV陰性患者50例，其中男26例，女24例，年齡15～64歲。所有選擇對象留取血清2ml，－80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑及儀器 乙肝兩對半試劑（上?？迫A生物工程有限公司），HBV－LP、PreS1、PreS2試劑盒（北京熱景生物技術(shù)有限公司），HBV－DNA檢測試劑盒（廣州中山達(dá)安基因有限公司），肝功能檢測試劑盒和相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品及質(zhì)控品（中生北控生物科技股份有限公司），酶標(biāo)儀，日立7600生化分析儀等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 按試劑盒說明書要求ELISA方法檢測二對半、HBV－LP、PreS1、PreS2，按要求設(shè)定cut－off值，讀取各孔OD值。HBV－DNA檢測按照說明書要求進(jìn)行。肝功能檢測按照要求設(shè)置測試協(xié)議，于生化分析儀檢測。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t或t’檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 HBV－LP表達(dá)與 HBV－DNA拷貝數(shù)的關(guān)系180例 HBV感染者，血清 HBV－LP與 HBV－DNA的陽性符合率為94.6%（123／130），陰性符合率為66.0%（33／50），總符合率為86.7%，HBV－LP陽性率（77.8%）與 HBV－DNA 陽性率（72.2%）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。通過分析 HBV－LP各孔吸光度值（OD值）與HBV－DNA拷貝數(shù)（取log值）關(guān)系，HBV－LP表達(dá)與HBV－DNA拷貝數(shù)呈正相關(guān)（r＝0.53，P＜0.05）

2.2 二對半模式中HBV－LP和HBV－DNA檢測結(jié)果 檢出HBsAg、HBeAg、HBcAb陽性（1，3，5陽性模式）125例，HBV－LP陽性率92.0%（115／125），HBV－DNA陽性率91.9%（75／80），兩者陽性率比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。檢出HBsAg、HBeAb、HBcAb陽性52例（1，4，5陽性模式），HBV－LP陽性率51.9%（27／52），HBV－DNA陽性率42.3%（22／52），兩者陽性率比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。其他二對半模式數(shù)量較少，暫不統(tǒng)計(jì)。

2.3 HBV－LP與Pres1、Pres2表達(dá)的關(guān)系 180例樣本HBV－LP、PreS1、PreS2陽性率分別為77.8%、58.9%、96.1%，HBV－LP陽性率明顯高于 PreS1（P＜0.01），HBV－LP陽性率低于PreS2（P＜0.01）。

2.4 HBV－LP表達(dá)與肝功能指標(biāo)間的關(guān)系 HBV陽性患者的ALT（谷丙轉(zhuǎn)氨酶）、AST（谷草轉(zhuǎn)氨酶）水平高于 HBV－LP陰性患者（P均＜0.05），T－BIL（總膽紅素）、TP（總蛋白）、Alb（白蛋白）水平差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見表1）。

表1 HBV－LP表達(dá)與肝功能的結(jié)果

3 討論

HBV感染在我國屬于危害較重的傳染性疾病，目前臨床判斷患者病毒是否復(fù)制，常用指標(biāo)是HBeAg和HBV－DNA。臨床發(fā)現(xiàn)一部分HBeAg陰性患者，但病毒依然大量復(fù)制，而HBV－DNA檢測條件要求高，質(zhì)量控制嚴(yán)格，使其檢測難以廣泛普及。一般抗病毒治療終點(diǎn)選擇是HBeAg和HBVDNA轉(zhuǎn)陰，但這部分轉(zhuǎn)陰的患者病情常出現(xiàn)反復(fù)。當(dāng)前需要一種新的指標(biāo)來反映HBV的復(fù)制狀況。HBV的S基因編碼3種外膜蛋白：主蛋白（HB－sAg）、中蛋白（HBsAg和Pre－s2蛋白）、大蛋白（HB－sAg、Pre－s1蛋白和 Pre－s2蛋白，HBV－LP），研究證明HBV－LP在病毒復(fù)制過程中起著關(guān)鍵作用，可作為受體蛋白與細(xì)胞受體結(jié)合介導(dǎo)病毒粒子的細(xì)胞內(nèi)攝入，并參與病毒粒子的組裝和分泌，還可以反式激活細(xì)胞內(nèi)病毒的復(fù)制等［3，4，6］。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HBV－LP與HBV－DNA有明顯相關(guān)性，提示HBV－LP的表達(dá)與病毒的復(fù)制有關(guān)，這為臨床判斷病毒病毒復(fù)制與否，提供新的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。我們也發(fā)現(xiàn)7例樣本HBV－DNA陽性而HBVLP陰性，可能與PCR技術(shù)的高靈敏度有關(guān)［7］，同時(shí)有17例樣本HBV－DNA陰性而HBV－LP陽性，因?yàn)镠BV感染者血清中有3種顆粒：小球型顆粒、管型顆粒、Dane顆粒，其中管型顆粒和Dane顆粒表面有HBV－LP，這部分患者可能血清中含有管型顆粒而無Dane顆粒，而且HBV－LP在外周血消失需要一定的半衰期，有研究發(fā)現(xiàn)抗病毒治療后，HBV－LP的消失比HBV－DNA晚［8］，也有可能雖然血清中檢測不出HBV－DNA，但肝細(xì)胞內(nèi)病毒仍在復(fù)制，由于病毒復(fù)制時(shí)，需要 HBV－LP的合成，使得 HBV－LP較早釋放入血。當(dāng)前，用于抗HBV的胞苷類藥物主要抑制DNA聚合酶活性，以肝功能改善和HBVDNA轉(zhuǎn)陰來選擇治療終點(diǎn)，但一部分患者雖然HBV－DNA轉(zhuǎn)陰，但很快病情出現(xiàn)反彈，這可能與HBV－LP繼續(xù)表達(dá)，反式激活病毒復(fù)制有關(guān)。Gripon等研究發(fā)現(xiàn)［9］，源于大蛋白的乙酰化肽段能夠使肝細(xì)胞表面的受體失活，切斷病毒感染其他肝細(xì)胞的途徑，這為抗病毒靶點(diǎn)及治療終點(diǎn)的選擇提供新的可能，也提示HBV－LP檢測或許可以檢測抗病毒療效，但這需要更加全面深入的研究。

本實(shí)驗(yàn)分析兩種常見二對半模式HBV患者發(fā)現(xiàn)，HBV－LP和 HBV－DNA陽性率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，HBeAg陽性患者，HBV－LP和 HBV－DNA陽性率均較高，提示病毒正在復(fù)制，但是HBeAg陰性患者，HBV－LP和HBV－DNA都有一定的陽性率。由于迫于機(jī)體免疫壓力和藥物壓力等，造成HBV基因組的前C區(qū)和核心啟動子變異，HBeAg轉(zhuǎn)陰，但病毒仍然在復(fù)制，以上實(shí)驗(yàn)說明HBV－LP比HBeAg反映病毒復(fù)制更加確切和靈敏。同時(shí)比較HBV－LP和PreS1、PreS2表達(dá)發(fā)現(xiàn)，HBV－LP陽性率明顯高于PreS1，而低于PreS2表達(dá)。根據(jù)HBV外膜蛋白的結(jié)構(gòu)，只有HBV－LP中包括PreS1，造成這種檢測率的差異，主要與選擇單克隆抗體有關(guān)，檢測PreS1的抗體是針對其線性表位，PreS1抗原的表位在形成空間構(gòu)象時(shí)，只有一部分關(guān)鍵氨基酸序列暴露在外［4］，由此造成PreS1檢出率偏低，而HBV－LP檢測采用的是立體構(gòu)象表位。本實(shí)驗(yàn)PreS2蛋白檢出率均較高，一般情況下，HBV感染者不會只有小蛋白表達(dá)，而且一旦發(fā)生PreS2表達(dá)缺失，會引起肝細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p失，雖然PreS2表達(dá)與病毒的復(fù)制有關(guān)，但本實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示其檢測缺少一定的特異性，從而限制其在臨床的應(yīng)用。通過對所選樣本的肝功能分析發(fā)現(xiàn)，HBV－LP陽性患者的ALT、AST水平高于HBV－LP陰性患者，由于ALT及AST是反映肝細(xì)胞損傷極為靈敏的指標(biāo)，提示HBV－LP的表達(dá)與肝細(xì)胞損傷有關(guān)，而其T－BIL（反映肝細(xì)胞處理毒素的能力）、TP和Alb（一定程度反映肝細(xì)胞合成功能）的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，主要與肝細(xì)胞有強(qiáng)大的代償能力有關(guān)。

總之，HBV－LP的表達(dá)是病毒復(fù)制的指標(biāo)之一，由于其檢測簡單、快速，在基層醫(yī)院有著較好應(yīng)用前景，是血清學(xué)檢測指標(biāo)的有益補(bǔ)充。

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