維生素E對心肌氧化損傷的保護作用研究

陳 昕，趙 雷，韓蘊琪，孫 波，石 毅，周余來

（1.暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院深圳市人民醫(yī)院 檢驗科，廣東 深圳518020；2.吉林大學(xué)藥學(xué)院 生物工程教研室，吉林 長春130021）

在人體的許多生理過程之中都有自由基的參與。心肌細胞是一種對自由基毒性敏感的組織，因為它含有豐富的酶和膜組織，二者都易被自由基所破壞。在多種心肌細胞損傷的情況下，均發(fā)現(xiàn)心肌細胞內(nèi)有過量的自由基的產(chǎn)生［1，2］。因此，能夠清除自由基，減輕過氧化損傷的藥物即可對心肌細胞產(chǎn)生保護作用。維生素E能清除體內(nèi)的自由基，是一種常用的抗氧化藥物［3］。本實驗旨在驗證維生素E對阿霉素產(chǎn)生的心肌細胞過氧化損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和試劑

實驗使用新生 Wistar大鼠，清潔級，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供（動物飼養(yǎng)合格證號：NO：0010281）；新生小牛血清由Gibco公司提供；MEM培養(yǎng)基由Gibco公司提供；胰蛋白酶由HYCLONE公司提供；鹽酸阿霉素為浙江海正藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品；山莨菪堿為天津藥業(yè)集團新鄭股份有限公司產(chǎn)品；乳酸脫氫酶（LDHI）測定試劑盒、一氧化氮合成酶（NOS）測定試劑盒、丙二醛（MDA）測定試劑盒為南京建成生物有限公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳鼠心肌原代培養(yǎng) 取新生Wistar大鼠心肌細胞培養(yǎng)于MEM培養(yǎng)液中，加入10%滅活胎牛血清，細胞濃度1×105／ml，每孔200μl接種至96孔板中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24h后，觀察細胞，當心肌細胞貼壁后，換液。在培養(yǎng)48h后，可見心肌細胞連接成片，并產(chǎn)生有節(jié)律的自主跳動。

1.2.2 實驗分組及造模給藥方法 約48h之后，將培養(yǎng)細胞分組給藥。空白對照組加MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；模型組加阿霉素濃度為2μg／ml的 MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；藥物保護組分設(shè)3種濃度梯度分別加150μg／ml維生素E＋2μg／ml阿霉素、300μg／ml維生素E＋2μg／ml阿霉素和600μg／ml維生素E＋2μg／ml阿霉素。

1.3 檢測指標

1.3.1 細胞形態(tài)學(xué)觀察 心肌細胞培養(yǎng)24h后，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)，細胞的生長狀態(tài)以及細胞的搏動率。

1.3.2 細胞損傷生化指標測定 在心肌細胞給藥培養(yǎng)48h后，按試劑盒說明書檢測培養(yǎng)液上清LDH和NOS含量；檢測培養(yǎng)心肌細胞超聲破碎得到細胞混懸液檢測MDA的含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)以±s表示，數(shù)據(jù)用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS V13.0進行處理。多組間的比較用單因素方差分析，P＜0.05為有顯著性差異，P＜0.01為有非常顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 心肌細胞的形態(tài)學(xué)影響

在細胞貼壁24h后，即可見心肌細胞已連結(jié)成片，有自主有規(guī)則的搏動。在給藥之后，分別觀察空白對照組、損傷組和藥物修復(fù)組，發(fā)現(xiàn)組間已具有明顯的形態(tài)差異：.空白對照組（見圖1）：心肌細胞成多邊形生長狀態(tài)良好，細胞邊緣清晰，相互通過偽足連接成片，細胞間有相互偶聯(lián)的自主搏動，搏動穩(wěn)定；模型組（見圖2）：模型組形態(tài)改變明顯，細胞皺縮，細胞的邊緣不清晰，自主節(jié)律跳動消失，細胞間的連接被破壞，偶見漂浮的細胞；修復(fù)組心肌細胞（見圖3）：多數(shù)細胞邊緣清晰，仍有自主搏動，但部分細胞可見邊緣模糊，自主搏動消失等破壞現(xiàn)象。

圖1 空白對照組的心肌細胞（×100）

圖2 阿霉素組的心肌細胞（×100）

圖3 維生素E修復(fù)組的心肌細胞（×100）

2.2 維生素E對阿霉素造成的心肌細胞損傷的保護作用

各組細胞給藥后培養(yǎng)達48h時，阿霉素損傷組心肌細胞培養(yǎng)基中LDH、NOS和MDA含量明顯增加，與正常組比較差異非常顯著（P＜0.01）；藥物保護組的LDH、NOS和MDA含量較阿霉素損傷組降低，差異明顯（P＜0.01或P＜0.05）且降低呈現(xiàn)劑量依賴性。見表1。

表1 維生素E對阿霉素引起的心肌細胞損傷的作用

3 討論

自由基是一種機體代謝的中間產(chǎn)物，是能獨立存在的含有一個或一個以上的不配對電子的原子或原子團。它有很強的氧化反應(yīng)能力，可以產(chǎn)生連鎖反應(yīng)損傷機體。它所造成的損傷主要有破壞核酸結(jié)構(gòu)發(fā)生基因突變；使不飽和脂肪酸產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化；使蛋白質(zhì)和糖類等大分子發(fā)生交聯(lián)。伴隨著這些生物大分子結(jié)構(gòu)的破壞，細胞的代謝活動會受到較大的影響，如阻礙呼吸作用中的電子鏈傳遞，引起細胞凋亡，破壞離子轉(zhuǎn)運，改變細胞內(nèi)液成分等等。

阿霉素是臨床上廣泛應(yīng)用的抗癌藥物，由于其特定的結(jié)構(gòu)，在進入心肌細胞后分別在微粒體和線粒體中產(chǎn)生O2、OH、H2O2等氧自由基，作用于心肌細胞膜及各種細胞器膜上磷脂中的多價不飽和脂肪酸，形成脂質(zhì)自由基，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，并影響膜上功能蛋白質(zhì)的位置及構(gòu)型，最終導(dǎo)致膜的完整性遭到破壞，膜的流動性降低，通透性增加，容量調(diào)節(jié)功能及離子轉(zhuǎn)運功能障礙［4］。另外，阿霉素使心肌細胞主要的抗氧自由基酶活性降低，而不能有效地保護心肌細胞免受氧自由基的損傷。因此心臟毒性是阿霉素最為主要的副作用之一，這嚴重制約了它在臨床的應(yīng)用?？梢妼ふ矣行У囊种瓢⒚顾匦呐K毒性的藥物在臨床具有重要的意義。

維生素E是細胞內(nèi)存在的高效自由基清除劑和脂質(zhì)過氧化作用的阻斷劑。研究證明，它能夠有效的保護心血管系統(tǒng)減少心血管病的發(fā)病率［5，6］，對克山病、缺血再灌注損傷均有療效［7］。在本實驗以心肌細胞作為研究對象，體外以阿霉素誘導(dǎo)損傷構(gòu)建細胞病理模型，從細胞形態(tài)學(xué)、乳酸脫氫酶含量、一氧化氮合成酶含量、丙二醛含量等方面觀察了維生素E對ADM中毒心肌細胞的保護。

由于過氧化損傷可造成心肌細胞的脂膜損傷，導(dǎo)致心肌細胞線粒體內(nèi)富含的氧化酶類外漏，因此心肌細胞培養(yǎng)液之中的LDH作為衡量心肌細胞生長狀態(tài)的有效指標，可反映心肌細胞細胞膜因脂質(zhì)過氧化作用而受損的情況。模型組的LDH含量明顯增高，說明心肌細胞的線粒體膜在受損之后已發(fā)生崩解導(dǎo)致LDH外漏。而藥物保護組（維生素E）LDH濃度明顯減低，說明維生素E可以減輕線粒體膜的崩解程度，對阿霉素造成的心肌氧化損傷有保護作用。

NOS是另一種衡量心肌細胞代謝狀態(tài)的有效指標，可由阿霉素誘導(dǎo)產(chǎn)生。有研究發(fā)現(xiàn)，一氧化氮合酶（NOS）可使細胞產(chǎn)生NO增加，與阿霉素致心肌細胞產(chǎn)生增加的O2－反應(yīng)生成過氧亞硝基陰離子（ONOO－）。ONOO－是一種強氧化劑，可迅速分解為高活性的OH－和NO等自由基，參與脂質(zhì)過氧化。本實驗中，損傷模型組的NOS含量高于空白對照組，說明損傷模型組心肌細胞受阿霉素氧化損傷后被誘導(dǎo)產(chǎn)生較多NOS。而在藥物保護保護組，該指標明顯較低，表示維生素E能夠有效的抑制NOS的誘導(dǎo)產(chǎn)生，從而防止產(chǎn)生高活性的OH－和NO等自由基，抑制脂質(zhì)過氧化，有效的保護了心肌細胞。

質(zhì)膜上的脂肪酸會在自由基的作用之下產(chǎn)生丙二醛（MDA）等產(chǎn)物，且丙二醛的含量和受損程度相關(guān)，因此MDA含量能間接的反映細胞受損的程度。模型組的MDA含量要比空白對照組明顯增高，說明模型組細胞經(jīng)脂質(zhì)過氧化損傷之后產(chǎn)生MDA。藥物保護組的MDA含量較模型組明顯下降，說明維生素E作為生物體內(nèi)常見的還原劑，可以有效的阻礙自由基對不飽和脂肪酸的進攻，從而減少MDA的產(chǎn)生。

本研究顯示維生素E分別從線粒體膜的崩解、自由基誘導(dǎo)生成、不飽和脂肪酸被氧化的三個方面發(fā)揮作用，有效地減輕ADM引起的心肌細胞損傷、保存細胞活力、維持相對規(guī)律的心肌搏動，對心肌細胞有保護作用。因此維生素E在減輕阿霉素等蒽環(huán)類藥物的心臟毒性作用，提高化療期癌癥病人的生存質(zhì)量上有較大的應(yīng)用價值。

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