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    植物硒形態(tài)分析的研究綜述

    2012-11-24 07:08:26程建中桂仁意
    關(guān)鍵詞:質(zhì)譜化合物色譜

    程建中,楊 萍,桂仁意

    (浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地,浙江 臨安311300)

    硒(Se)是人和動物必須的微量元素,具有防癌抗癌,清除體內(nèi)自由基,抗衰老等作用[1-2]。研究證明: 克山病(Keshan disease),大骨節(jié)病(Kaschin-Beek disease),糖尿病(diabetes),艾滋病(AIDS)等 40多種疾病與缺硒有關(guān)[3]。1932年,人們從植物體中檢測出硒,發(fā)現(xiàn)人或動物攝取的硒都直接或間接來自于植物,植物硒具有較高的生物利用度和生物活性[4],并且植物硒的生物功能與其形態(tài)和含量密切相關(guān)。作者對近年來國內(nèi)外植物硒形態(tài)分析研究予以綜述。

    1 植物硒形態(tài)存在形式及代謝途徑

    硒被植物吸收后,形成非常復(fù)雜的化學(xué)形態(tài),分為無機硒和有機硒兩大類。無機硒較少,包括硒酸、亞硒酸和其他一些無機形態(tài)(如Se2-和HSe-),且主要以Se(Ⅳ)形式存在。有機硒占硒總量80%以上,由大分子硒和以硒代氨基酸及其衍生物形式存在的小分子硒化物(表1)組成;大分子硒主要包括硒蛋白、硒核酸和硒多糖等,小分子硒化物包括硒甲基硒半胱氨酸、硒代高胱氨酸、硒代蛋氨酸和硒肽等[7]。硒代氨基酸是人日常膳食中獲取硒的主要來源。

    表1 植物中有機小分子硒化合物[5-6]Table 1 Small organic molecule Se-compounds in plants

    由于硒和硫有相似的物理和化學(xué)性質(zhì),目前,通過植物體中硫的代謝途徑來研究硒的代謝過程。植物對硒的吸收依賴硫轉(zhuǎn)運體,這個過程是逆電化學(xué)式梯度的需能體現(xiàn)[8]。代謝過程(圖1)主要發(fā)生在植物的葉綠體和細胞質(zhì)中,其中關(guān)于代謝產(chǎn)物硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸和甲基硒代半胱氨酸的研究報道較多[11-13]。目前,植物含硒蛋白研究較多[14-15],對于植物體中有哪些大分子硒蛋白,還未見報道。

    2 硒形態(tài)樣品的提取

    由于硒形態(tài)的不穩(wěn)定性,樣品的提取過程盡量保持硒形態(tài)的原始特性不變,比僅僅檢測硒元素復(fù)雜得多,也是植物硒形態(tài)分析準確性的關(guān)鍵。目前,針對有機硒蛋白,大多數(shù)采用體積分數(shù)為75%乙醇,0.5 mol°L-1氯化鈉和 0.1 mol°L-1氫氧化鈉溶液進行提取[4]。余芳等[16]用 0.1 mol°L-1氫氧化鈉為提取液提取富硒茶葉中硒蛋白,確定料液比1∶30(g°mL-1),提取時間16 h,提取溫度40℃時的提取效率最高。在小分子硒形態(tài)方面,主要包括水提取法、酸提取法和酶提取法[17]。水提取對一些非結(jié)合蛋白形式的硒形態(tài)較適合,如硒-甲基硒代半胱氨酸、γ-谷氨?;?硒甲基硒代半胱氨酸,但對以蛋白形式結(jié)合的硒,回收率較差;酸提取法有很高的回收率,但酸易使硒形態(tài)發(fā)生轉(zhuǎn)變;酶提取法的應(yīng)用最廣(表2),常用的酶有蛋白酶K,蛋白酶XIV,胰蛋白酶,胃蛋白酶和鏈霉蛋白酶等。酶提取法通常在溫和的條件下(37℃,pH 7.0)進行,可以減少硒形態(tài)之間相互轉(zhuǎn)化,但此法提取的時間較長,一般需24~48 h。Emese等[12]對富硒北蔥Allium schoenoprasum硒形態(tài)分析采用2種方法進行提取:①對于非蛋白硒,用高氯酸-乙醇(8∶2)提??;②對于蛋白硒,采用酶解法。首先蛋白酶K溶于pH 7.5的三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖液(包含1 mmol°L-1氯化鈣2),所得到的溶液加入到韭菜Allium tuberosum樣品中,在50℃下攪拌15 h,后再加入蛋白酶XIV,同樣在50℃下攪拌15 h。在第1種提取方法下,檢測到MeSeCys,SeCys2,Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)等4種硒形態(tài),用第2種提取方法,檢測到5種硒形態(tài)(多檢測出SeMet),且酶解法得出的有機硒形態(tài)含量高于第1種方法。

    圖1 植物硒代謝途徑[9-10]Figure 1 Selenium metabolic fate in plants

    表2 近幾年植物樣品中硒形態(tài)酶解過程Table 2 Procedures of enzymatic hydrolysis for selenium species extractions in plants in recently years

    按照使用輔助儀器的不同,分為萃取提取、振搖提取、超聲提取、離心提取、微波提取等,其中超聲微波結(jié)合酶提取法可以有效地縮短提取時間[25],加壓液體萃取法(PLE)是未來研究的方向之一。該方法在分析錫和砷形態(tài)分析上得到應(yīng)用,但在硒形態(tài)分析上應(yīng)用較少[26]。

    3 硒形態(tài)分離聯(lián)用技術(shù)

    硒化物的分離技術(shù)主要有氣相色譜法(GC),液相色譜法(LC,表3)和電泳法等。植物體中揮發(fā)性的含硒化合物(如二甲基硒和二甲基二硒),應(yīng)用GC分離較方便,且檢測限可達到1 ng°L-1[27]。非揮發(fā)性(含硒氨基酸)和含硒手性化合物,采用GC方法會消耗大量時間,且不適用分離低聚肽的硒化合物。Janáak[28]利用氯甲酸乙酯同氨基酸基團特征反應(yīng)使SeMet和SeCys2等衍生成氣態(tài)化合物,再通過GC進行分離。

    表3 液相色譜應(yīng)用于植物樣品中硒形態(tài)分離Table 3 Examples of applications of different chromatographic liquid mechanisms for selenium species sepration in plant

    植物體硒形態(tài)多以非揮發(fā)性形式存在,高效液相色譜技術(shù)被廣泛應(yīng)用于分離植物體中各種硒形態(tài)(表3)。目前,用于硒形態(tài)分析高效液相色譜法(HPLC)包括體積排阻色譜(SEC-HPLC),離子交換色譜(IEC-HPLC)和反相離子對色譜(RP-IP-HPLC)。SEC-HPLC是一種溫和的分離方法,主要用于硒蛋白、硒多糖的檢測以及硒與蛋白相互作用的研究,主要分離的化合物分子量為10~1 000 kDa[31]。Mounicou等[32]用Superdex 75排阻色譜柱和Mono-Q 5/50GL強離子交換快速蛋白柱組成二維色譜分離法分析富硒芥菜Brassica juncea中含硒蛋白并分離其中的小分子含硒化合物。此外,體積排阻法可作為后面用離子交換和反相色譜分析小分子硒形態(tài)的前純化步驟。IEC-HPLC主要用來分離樣品中帶有電荷的化合物,根據(jù)各種物質(zhì)在離子交換柱中的保留時間不同將它們分開。由于植物無機硒中的Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)帶有負電荷,硒代氨基酸及其他小分子硒化合物在一定pH值條件下帶有正電荷,所以,離子交換色譜常被用來分析植物中小分子硒化合物[33]。RP-HPLC因其固定相不含有游離金屬配體化合物,在分離硒類生物分子化合物方面,效果優(yōu)于其他色譜方法,尤其適用于天然產(chǎn)物分離,是目前應(yīng)用最廣泛的分離硒化合物方法[34]。在RP-HPLC流動相中加入一種反離子試劑成為RP-IP-HPLC,它能同時分離帶有電荷和不帶電荷的化合物,且具有非常高的結(jié)果重復(fù)性和較短的分離時間。此外,緩沖液的濃度、pH值、流動相中的離子強度等都影響著反相離子對色譜的分辨力[33]。

    電泳法擁有高分辨率、低檢測限,且在分析過程中能保持樣品的完整性等優(yōu)點,在分析植物硒形態(tài)中應(yīng)用越來越廣。主要有毛細管電泳(CE)和凝膠電泳(GE)。CE以電滲流為驅(qū)動力、毛細管為分離通道,根據(jù)目標分子所帶電荷數(shù)與分子本身大小的比值進行分離,具有分離時間短、效果好、成本低、樣品耗用量少等優(yōu)勢,是高效液相色譜在形態(tài)分析方面的有效補充。Kannamkumarath等[35]用毛細管電泳-電感耦合等離子體質(zhì)譜 (CE-ICP-MS)對堅果中硒形態(tài)研究,在酶提取液中7 min內(nèi)分離出SeMet,SeCys2。Se(Ⅳ)和 Se(Ⅵ)。但由于 CE 和 ICP-MS 在聯(lián)用時,所需的流速不同(分別為 nL°min-1和 mL°min-1),所以接口技術(shù)的發(fā)展對推廣CE-ICP-MS在分析植物硒形態(tài)上的應(yīng)用至關(guān)重要[17]。凝膠電泳中聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)由于分辨率比HPLC高,在分析含硒蛋白方面應(yīng)用較多。用SDS-PAGE對粗米中的硒蛋白分析,共得到7組含硒蛋白膠條,分布在分子量13.6~121.4 kDa的蛋白質(zhì)中,且主要分布區(qū)域為13.6~15.8 kDa,84.34%的Se在分子量小于36.3 kDa的蛋白質(zhì)中被檢測到[15]。但是,具有不同硒蛋白組成的植物組織也可能在SDS-PAGE中有相同的分離速度,所以分離得到的蛋白膠條不能真實代表實際樣品蛋白組成,二維等電聚焦SDS-PAGE可較好改善分離效果,系統(tǒng)一次運行可分離幾千種蛋白質(zhì)[34]。此外,激光燒蝕等新技術(shù)也逐漸得到發(fā)展應(yīng)用[36]。

    4 硒形態(tài)檢測聯(lián)用技術(shù)

    在研究植物硒的各種化學(xué)形態(tài)時,檢測技術(shù)有電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS),原子吸收光譜(AAS),原子熒光光譜(AFS)和原子發(fā)射光譜(AES)等。ICP-MS有高靈敏度,高選擇性等優(yōu)點,然而,對于硒而言,由于其第一電離能較高(I1=9.752 eV),使得離子化效率相對較低,而且還存在多原子離子的干擾(40Ar和36Ar+對76Se,40Ar和37Ar+對77Se,40Ar和38Ar+對78Se等)。近年,隨著 ICP-MS中碰撞反應(yīng)池技術(shù)的發(fā)展[37],使得多原子對Se的干擾得到有效控制,加上ICP-MS與HPLC和CE耦合等優(yōu)點,高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜(HPLC-ICP-MS)和CE-ICP-MS已成為植物硒形態(tài)分析中應(yīng)用最多的聯(lián)用儀器(表3)。

    電噴霧質(zhì)譜(ES-MS),電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(ES-MS-MS)和二維凝膠色譜分離結(jié)合激光解吸飛行質(zhì)譜(MALDI-TOF)是目前在分析硒化合物結(jié)構(gòu)方面應(yīng)用較先進的技術(shù)。由于大分子硒化合物及鹽的影響,植物硒溶液不能直接進入ES-MS中進行分析,且ES-MS聯(lián)用技術(shù)檢測靈敏度要比ICP-MS聯(lián)用低,因此,在用ES-MS分析前,需要對植物樣品進行濃縮提純[4]。由于靈敏度不高,目前ES-MS僅在富硒能力強的植物上(蒜Allium sativum,洋蔥A.cepa等)應(yīng)用較多[38-39],在富硒能力弱的植物上應(yīng)用還有待發(fā)展。Dernovics等利用HPLC-ES-MS在巴西堅果Bertholletia excelsa中發(fā)現(xiàn)了大約15條硒多肽。此外,利用ES-MS技術(shù),已經(jīng)在酵母和動物體內(nèi)鑒定出一些硒蛋白的結(jié)構(gòu),但是在植物方面,尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)硒蛋白結(jié)構(gòu)的報道。MALDI-TOF是一種軟電離技術(shù),不產(chǎn)生或產(chǎn)生較少的碎片離子,適用于混合物及生物大分子的測定,準確度為0.10%~0.01%,遠遠高于目前常規(guī)應(yīng)用的SDS電泳等技術(shù),目前可測定生物大分子的分子量高達600 kDa,這可能是未來研究植物大分子硒化合物形態(tài)結(jié)構(gòu)的主要手段。

    同位素稀釋分析法(IDA)也是近年在硒形態(tài)分析上應(yīng)用較多的方法之一。植物硒形態(tài)在樣品處理和儲藏階段能夠相互轉(zhuǎn)化,同位素追蹤可以有效地解決這一問題。IDA的優(yōu)點是植物樣品與稀釋劑混合后同位素的比值不變,因此,不必考慮樣品處理過程中被測元素的損失。此外,植物樣品經(jīng)色譜分離后,在線加入待測元素同位素稀釋劑,再進入質(zhì)譜檢測完成同位素稀釋分析(柱后同位素稀釋法),可以對色譜分離所得到的未知結(jié)構(gòu)硒形態(tài)準確地定量,這是ES-MS技術(shù)所無法做到的。

    5 植物硒形態(tài)分析研究展望和應(yīng)用前景

    近20 a來,硒在毒理學(xué)、生理學(xué)及環(huán)境科學(xué)上的重要性愈來愈為人們重視,硒的測定方法研究從痕量和超痕量發(fā)展,向有機硒化合物測定的方向發(fā)展,聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展為分離檢測植物硒形態(tài)做出了重大貢獻,HPLC-ICP-MS是目前分析硒化合物應(yīng)用最多的方法之一,但還存在需要解決的問題:①由于硒形態(tài)的不穩(wěn)定性造成無法準確地定性定量,應(yīng)從減少硒形態(tài)的相互轉(zhuǎn)化和分析硒形態(tài)轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物2個方面進行研究,對植物樣品分析前應(yīng)該用冷凍干燥進行處理,防止應(yīng)用高溫烘干處理后,硒形態(tài)發(fā)生變化。也可以充分利用同位素稀釋分析法在對硒形態(tài)轉(zhuǎn)化上的應(yīng)用。②由于植物有機硒化合物種類繁多且含量低、標準品有限、目標化合物的不可知性、結(jié)構(gòu)鑒定儀器尚不令人滿意的靈敏度及其未充分開發(fā)的潛力等因素的限制,對其硒蛋白和含硒氨基酸等有機含硒化合物的直接分析仍存在著巨大的挑戰(zhàn),因此檢測分析方法實用化,儀器簡單化、標準化是硒形態(tài)研究的一個重要方向。

    目前,隨著含硒氨基酸密碼子(UGA)的破譯及含硒氨基酸進入蛋白質(zhì)機制的闡明,人們對硒的研究已深入到分子生物學(xué)水平,對硒的生物學(xué)作用的重要性認識進一步深入。硒在動物體內(nèi)的生理生化機制已越來越清楚,多種含硒蛋白逐漸被純化出來,其生理生化功能也逐漸成為營養(yǎng)學(xué)界所注目的焦點。因此,大分子植物硒蛋白方面的研究將是相關(guān)領(lǐng)域內(nèi)科研工作中的重點與方向,隨著植物各種硒蛋白和含硒蛋白的深入研究,以及硒與食品中其他營養(yǎng)物質(zhì)相互作用的探索,功能性食品(優(yōu)良的硒補充劑)的開發(fā)將有著極為廣闊的應(yīng)用前景。

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