山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因的表達(dá)與細(xì)胞凋亡的相關(guān)性

關(guān)會敏，冉雪琴，姬志林，王嘉福，3

（1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽550025；2.楚雄醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校醫(yī)學(xué)檢驗系，云南 楚雄675000；3.貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程省重點實驗室，貴州 貴陽550025）

山羊痘病毒（goat pox virus，GPV）為DNA病毒，屬痘病毒科（Poxviridae）、脊索動物痘病毒亞科（Chordopoxrinae）、羊痘病毒屬（Capripoxvirus），是引起山羊痘的直接病原，羔羊易感，接觸感染率可達(dá)100%。山羊痘為急性、熱性傳染病，臨床癥狀以皮膚、呼吸道及消化道等黏膜處出現(xiàn)痘疹為主［1］，發(fā)病率和死亡率均較高，嚴(yán)重影響了山羊養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。痘病毒是惟一可以在感染細(xì)胞的胞質(zhì)中獨立復(fù)制的病毒［1］。在痘病毒侵入宿主細(xì)胞的初期，需在活細(xì)胞內(nèi)完成病毒粒子的復(fù)制和組裝等過程，因此病毒進(jìn)化出特殊的機(jī)制在感染的早期，阻礙宿主細(xì)胞過快地發(fā)生細(xì)胞凋亡或死亡。多數(shù)痘病毒家族可產(chǎn)生抗細(xì)胞凋亡因子，目前已知的痘病毒抗凋亡蛋白主要有：牛痘病毒編碼的CrmA蛋白，人傳染性軟疣病毒蛋白 MC159／160，黏液瘤病毒編碼的M11L蛋白。但GPV是否產(chǎn)生抗凋亡蛋白還不清楚。本文著重研究GPV編碼的抗凋亡蛋白基因結(jié)構(gòu)及其致病機(jī)制。

1 材料與試劑

1.1 材料 山羊痘病毒株（LD株）由貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院分離［2］，Vero細(xì)胞，購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，大腸桿菌DH5α和載體pBluscript.SK由本實驗室保藏。

1.2 試劑 RM1640／M199干粉為Gibco公司產(chǎn)品，胎牛血清由HyClone公司生產(chǎn)，PCR相關(guān)試劑，購自天根生化科技（北京）有限公司，RNA fast200總RNA極速抽提試劑盒，購自上海飛捷生物公司，引物和堿基序列的測定由上海捷瑞生物科技有限公司完成。

2 方法

2.1 細(xì)胞及病毒的培養(yǎng) Vero細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的RM1640培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)成單層。接毒GPV（MOI＝50），吸附1～1.5h，加入含2%胎牛血清的RM1640培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，當(dāng)70%～80%細(xì)胞脫落時，胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，反復(fù)凍融，4 000 r／min離心20min，取上清－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞病變及凋亡檢測 取GPV感染0、12、18、24、36、48h的 Vero細(xì)胞，觀察細(xì)胞的形態(tài)變化；0.4%臺盼藍(lán)染色，計數(shù)死亡細(xì)胞數(shù)并計算細(xì)胞的死亡率（死細(xì)胞／總細(xì)胞數(shù)×100%）；吖啶橙（AO）／溴乙錠（EB）混合染色［3］，計數(shù)細(xì)胞凋亡數(shù)并計算細(xì)胞的凋亡率（凋亡細(xì)胞／總細(xì)胞數(shù)×100%）。

2.3 病毒基因組的提?。?］病毒液經(jīng)SDS和蛋白酶K，56℃水浴消化1h，加入等體積的酚－氯仿－異戊醇（25∶24∶1）溶液抽提，離心，取上清，3mol／L醋酸鈉（pH 值5.2）和無水乙醇，－20℃沉淀30 min，于4℃ 12 000r／min離心15min，取沉淀用70%乙醇洗滌2次，離心，自然干燥，溶于TE溶液。2.4 基因的擴(kuò)增及克隆

2.4.1 引物設(shè)計 據(jù)已知序列設(shè)計P1／P2、P3／P4兩對特異性引物，其中P1／P2用于山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因的克隆，P3／P4用于基因表達(dá)的檢測。引物堿基序列為：P1：5′－GTGCTCTTCCAACATGGATAACTATAACTACAACA－TAG－3′，P2：5′－CCTCTGCAGTTACTTCCATCGTA TCCTACC－3′，下劃線部分為SapⅠ和PstⅠ酶切位點；P3：5′－GAATGTGTACTTGCGAGACT－3′，P4：5′－CTTCC ATCGTATCCTACCAAT－3′，另設(shè)計一對引物P5／P6，分析β－actin基因的表達(dá)量作為內(nèi)參照，P5：5′－GGCTACA GCTTCACCACCAC－3′，P6：5′－TACTCCTGCTT GCTGATCCAC－3′。

2.4.2 基因的擴(kuò)增及克隆 以1μg山羊痘病毒基因組DNA為模板，P1／P2為引物，擴(kuò)增山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因，擴(kuò)增條件：94℃變性8min；94℃40s，55℃30s，72℃30s，30個循環(huán)；72℃ 5min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，染色，觀察，回收目的片段，SapⅠ和PstⅠ雙酶切，與pBluscript.SK質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，涂布LB平板（含氨芐西林），37℃培養(yǎng)過夜，挑取陽性克隆。經(jīng)質(zhì)粒大小、菌落PCR和質(zhì)粒PCR鑒定為陽性的重組子測定堿基序列。

2.5 GPV抗凋亡蛋白基因的RT－PCR分析 提取細(xì)胞和病毒總RNA，經(jīng)甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，合格樣本經(jīng)反轉(zhuǎn)錄，以引物P3／P4擴(kuò)增山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因片段，同期以引物P5／P6檢測β－actin基因的表達(dá)量為內(nèi)參。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，Gene tools軟件（Gene co.）分析基因的相對表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞凋亡率及死亡率 與對照組（圖1A）相比，GPV感染Vero細(xì)胞24h之前，細(xì)胞的形態(tài)沒有明顯的變化，24h之后出現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)改變：細(xì)胞變圓，聚集成堆、拉絲、脫落（圖1B），48h時，細(xì)胞大量脫落、裂解。臺盼藍(lán)染色結(jié)果顯示，隨著病毒感染時間的延長，Vero細(xì)胞的死亡率逐漸增加：36h約為80%，48h接近100%（圖2）。經(jīng)AO／EB染色，隨機(jī)計數(shù)200個細(xì)胞，計算細(xì)胞的凋亡率。與對照組相比，至24h時沒有明顯的細(xì)胞凋亡，36h時檢測到凋亡細(xì)胞，以早期凋亡為主，48h細(xì)胞凋亡率明顯增加至13%，且以晚期凋亡為主，同時壞死細(xì)胞也隨之快速遞增，達(dá)到87%（圖3）。

3.2 山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因的克隆 以P1／P2為引物PCR擴(kuò)增，獲得1條約530bp的條帶（圖4，5），經(jīng)克隆測序（圖6），證實重組子中含有插入片段531bp，經(jīng)NCBI核酸庫在線比對，確認(rèn)本文克隆到的531bp DNA片段確為山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因（goat pox virus antiapoptosis protein），命名為GGPVAP基因，作為一個獨立的基因登錄到Gen－Bank上（EF536858）。

圖5 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

在GGPVAP序列中，（A＋T）對的含量為77.97%，基因編碼完整的抗凋亡蛋白，由176個氨基酸組成，分子量20.76kD，等電點（PI）7.58。經(jīng)NCBI蛋白庫在線分析，與GTPV＿gp014相似性100%，與LSDV017相似性為96%，與SPPV－14的相似性為95%，均屬于抗凋亡膜蛋白PHA02855超家族，具有固定的結(jié)構(gòu)域，且與M11L蛋白家族固定結(jié)構(gòu)域類似。

以DSA軟件（www.expasy.org）進(jìn)行在線分析，GGPVAP蛋白的C端有一顯著跨膜域，含有22個氨基酸，位于146～167位氨基酸區(qū)段，而M11L蛋白的C端也有類似的跨膜域，且均是由外向內(nèi)。在跨膜域內(nèi)，154、155、158三個位點的氨基酸高度保守，分別是纈氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸，均為疏水性氨基酸，推測其在跨膜結(jié)構(gòu)中起著重要的作用。

3.3 GGPVAP基因的表達(dá)變化 以提取細(xì)胞和病毒總RNA為模板，以β－actin為內(nèi)參照，經(jīng)RT－PCR對GGPVAP基因的表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，隨著感染時間的延長，GGPVAP基因的表達(dá)量逐漸上升，至24h時達(dá)到最大（P＜0.05），之后轉(zhuǎn)而下降，36h時降到12h時的水平（P＞0.05）（圖7）。

4 討論

以本地分離的山羊痘病毒（GPV）感染敏感的Vero細(xì)胞，至24h時之前未檢測到Vero細(xì)胞的凋亡，GPV作用48h時才檢測到Vero細(xì)胞凋亡，凋亡率13%，同時以臺盼藍(lán)染色檢測到Vero細(xì)胞的大量壞死。大腸桿菌志賀樣毒素Stx2（2μg／mL）作用Vero細(xì)胞24h細(xì)胞的凋亡率就達(dá)到了90%［5］。相比之下，山羊痘病毒感染Vero細(xì)胞的凋亡率明顯偏低，提示本地分離的山羊痘病毒作用于Vero細(xì)胞后凋亡發(fā)生的時間被推遲。進(jìn)一步研究GPV感染Vero細(xì)胞過程中GGPVAP基因的表達(dá)量變化，結(jié)果顯示，GGPVAP基因的表達(dá)量24h時出現(xiàn)峰值，之后轉(zhuǎn)而下降，與Vero細(xì)胞凋亡率的變化呈反變關(guān)系。

圖7 GGPVAP基因的表達(dá)變化

牛痘病毒編碼的CrmA蛋白是抗凋亡蛋白因子之一，可直接作用于IL－1β轉(zhuǎn)化酶，抑制caspase的活化，阻斷細(xì)胞凋亡的信號傳遞，抑制細(xì)胞凋亡［6］；人傳染性軟疣病毒的 MC159／160蛋白，阻止caspase 8的活化，阻斷Fas和TNFR1介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［7］；黏液瘤病毒編碼的 M11L蛋白定位于線粒體膜上，通過與Bak和Bax作用阻止線粒體凋亡途徑的發(fā)生［8］。從貴州山羊痘病毒基因組中分離出山羊痘病毒的抗凋亡蛋白，與同屬病毒凋亡蛋白的相似性95%～100%，M11L家族蛋白相似性為31%～36%，由此明確克隆到的基因GGPVAP確為山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因。同時，GGPVAP蛋白的C－端含有與痘病毒家族抗凋亡蛋白類似的跨膜域，提示該跨膜域可能作為細(xì)胞內(nèi)膜性受體或離子通道，抑制細(xì)胞凋亡信號的傳導(dǎo)，起到延緩或抑制Vero細(xì)胞凋亡的作用。細(xì)胞凋亡是宿主細(xì)胞對病毒感染的主動防御機(jī)制之一，是免疫監(jiān)控的一部分。被感染的細(xì)胞以凋亡方式阻止病毒繁殖，保護(hù)其他的組織細(xì)胞免遭病毒的侵害。GPV一旦進(jìn)入宿主山羊的體內(nèi)，就能迅速增殖，動物之間的傳染率高、發(fā)病率也較高。由此推測GPV侵入后，表達(dá)的山羊痘病毒抗凋亡蛋白可以有效阻止宿主細(xì)胞的凋亡進(jìn)程，至24h（可改為“至24h”），病毒已基本完成了病毒粒子的復(fù)制及其裝配過程［1］，結(jié)合本文的檢測結(jié)果，24h后山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因的表達(dá)量下降，宿主細(xì)胞的凋亡或壞死得以發(fā)生，此時細(xì)胞發(fā)生的壞死導(dǎo)致的破裂則有助于病毒的釋放，進(jìn)一步侵染其他的細(xì)胞。

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