C型產(chǎn)氣莢膜梭菌致麋鹿死亡病例

劉 燕，李偉杰，普天春，趙 京，閻 鶴，楊明海，原 蕾，張成林

（1.北京動物園，北京 西城100044；2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 海淀100081）

2011年初，本園飼養(yǎng)于十三陵繁育基地的多只麋鹿出現(xiàn)猝死，剖檢后發(fā)現(xiàn)多處臟器出血嚴(yán)重。心血涂片見到革蘭陽性呈短鏈大桿菌。腸內(nèi)容物涂片也見到大量可形成芽孢的革蘭陽性菌，厭氧環(huán)境下培養(yǎng)出大量產(chǎn)氣莢膜梭菌，經(jīng)PCR鑒定其血清型為C型。報告如下。

1 發(fā)病及剖檢情況

本園飼養(yǎng)于十三陵的麋鹿處于半散養(yǎng)狀態(tài)，這些麋鹿死前膘情都比較好。本次麋鹿發(fā)病非常急，幾乎可以說死前沒有觀察到任何癥狀，并且3d內(nèi)該群的麋鹿死亡數(shù)量過半。剖檢發(fā)現(xiàn)各臟器出血嚴(yán)重。整個腸道黏膜充血，特別是小腸充血、出血，黏膜脫落，腸系膜血管努張，腸系膜淋巴結(jié)腫脹、充血，出現(xiàn)血灌腸現(xiàn)象。

2 實驗室檢驗

2.1 病原菌分離 對送檢的4頭麋鹿的臟器和腸內(nèi)容物進(jìn)行涂片，用革蘭和美藍(lán)染色鏡檢并分別進(jìn)行培養(yǎng)。采用需氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)同時進(jìn)行。4只麋鹿的腸內(nèi)容物和1頭麋鹿的血液在厭氧條件下均分離出雙溶血環(huán)細(xì)菌。其他臟器未分離到有意義細(xì)菌。

2.2 病原菌的鑒定 對具有雙溶血環(huán)的細(xì)菌進(jìn)行革蘭染色鏡檢，可見到兩端鈍圓、短粗的革蘭陽性菌，呈單個或成雙排列，具有莢膜，少數(shù)能形成芽孢。培養(yǎng)特性檢查將初步分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌分別接種于綿羊脫纖維血瓊脂平板置于厭氧培養(yǎng)。結(jié)果綿羊血液瓊脂的菌落整齊、表面光滑隆起，呈乳白色大菌落，有雙層溶血環(huán)。菌落特征均符合產(chǎn)氣莢膜梭菌的培養(yǎng)性狀。選擇法國梅里埃公司的鑒定厭氧菌的試劑條API20A進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果為99%是產(chǎn)氣莢膜梭菌。

2.3 血清型鑒定 根據(jù)產(chǎn)氣莢膜梭菌α，β，ε，τ毒素基因cpa、cpb、etx及iA序列合成了針對4種毒素基因的4對特異引物，利用菌落多重PCR的方法，進(jìn)行血清型鑒定。PCR反應(yīng)總量為50μL，取一潔凈薄壁PCR管，依次加入10×PCR緩沖液（含25mmol／mL MgCl2）5μL、4 對引物（25nmol／mL）各1μL、dNTPs（10mmol／mL）2μL、雙蒸水33 μL，從4℃冰箱取出各菌株血平板培養(yǎng)物，用火菌槍頭挑取平板上的單個菌落，懸浮于各PCR管，于PCR儀上94℃10min預(yù)變性，冰浴2min，分別加入Taq酶（5U／μL）2μl，于PCR儀進(jìn)行如下反應(yīng)：94℃30s，52℃30s，72℃1min 30s，進(jìn)行30個循環(huán)；然后72℃10min。PCR完成后取5μL PCR產(chǎn)物，在1.5%瓊脂糖凝膠中90伏30～40min，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照（見圖1）。

圖1 該菌株P(guān)CR擴增結(jié)果

產(chǎn)氣莢膜梭菌跟據(jù)其產(chǎn)生的毒素不同，可以分為5個血清型。具體分別為A型產(chǎn)α毒素，B型產(chǎn)α、β和ε毒素，C型產(chǎn)α和β毒素，D型產(chǎn)α和ε毒素，E型產(chǎn)α和τ毒素。每種毒素的片段大小是不同的。α毒素片段大小為324bp，β毒素片段大小為196bp，ε毒素片段大小為665bp，τ毒素片段大小為446bp。根據(jù)擴增結(jié)果，本次分離到的菌株擴增到大小分別為324bp和196bp的兩條片段，確定該株產(chǎn)氣莢膜梭菌為C型產(chǎn)氣莢膜梭菌。

2.4 藥敏試驗 選取臨床常用抗生素，進(jìn)行藥物敏感試驗。藥敏試驗采取K－B法。藥敏片購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)有限公司。結(jié)果是該菌對頭孢曲松和頭孢哌酮敏感；對慶大霉素、頭孢克圬、阿奇霉素、諾氟沙星、磺胺、紅霉素以及青霉素等均不敏感。

2.5 動物試驗 將初步分離鑒定的產(chǎn)氣莢膜梭菌接種于厭氣肉肝湯培養(yǎng)24h后，調(diào)節(jié)細(xì)菌濃度在109CFU／mL左右，分別以0.1、0.2、0.3mL三種注射量（每種注射量3只20g左右的小鼠）腹腔注射小鼠。對照組3只小鼠注射無菌的厭氣肉肝湯。結(jié)果是除對照組和1只注射0.1mL菌懸液的小鼠存活外，其余全部于12h內(nèi)死亡。對死亡小鼠進(jìn)行剖檢，臟器觸片和染色鏡檢，可見到與原培養(yǎng)物形態(tài)相同的帶莢膜的革蘭陽性短粗桿菌。說明該菌是小鼠死亡的致病菌株，并且毒力還很強。

3 結(jié)果與討論

麋鹿屬于鹿科麋鹿屬，是我國I級重點保護的瀕危野生動物。3000多年前的商代是麋鹿種群發(fā)展的鼎盛時期，隨著人類的持續(xù)獵殺和嚴(yán)重的棲息地破壞，麋鹿的野生種群于清末時期滅絕。目前，全世界現(xiàn)有的3 000多只麋鹿均是19世紀(jì)從我國引入到歐洲，集中散放在英國烏邦寺莊園的最后18頭麇鹿的后代。我國在北京動物園、北京麋鹿生態(tài)試驗中心等全國幾十個動物園、野生動園、保護區(qū)等有飼養(yǎng)。

因產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的動物猝死在國內(nèi)國外均有多次報道。在我國由于產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的麋鹿猝死也有多次報道，但一般都是由于A型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的。C型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的麋鹿猝死的情況比較少見。本次分離到的C型產(chǎn)氣莢膜梭菌是本次麋鹿大量死亡的致病菌。產(chǎn)氣莢膜梭菌引發(fā)的動物猝死一般是因為動物在一些應(yīng)激情況下或者采食情況發(fā)生變化，引起發(fā)酵產(chǎn)酸，使瘤胃的pH值降低，細(xì)菌產(chǎn)生的毒素，改變了腸道的通透性，使大量毒素進(jìn)入血液，引起全身毒血癥，發(fā)生休克而死。本次疾病發(fā)生后，本園對動物尸體，以及飼養(yǎng)環(huán)境全都做了妥善處理，并加強防疫意識，以及飼養(yǎng)管理條件，盡量減少此類病情的再次發(fā)生。