亞抑菌濃度黏菌素對大腸桿菌外膜蛋白表達(dá)量及氧氟沙星攝入量的影響

魏述永，吳俊偉，陳紅偉，李 賽，劉俊瑋

（西南大學(xué)榮昌校區(qū)動物醫(yī)學(xué)系，重慶 榮昌402460）

動物源大腸桿菌喹諾酮類藥物（Qs）耐藥性控制研究具有巨大的經(jīng)濟(jì)意義和社會意義，目前國內(nèi)外研究主要集中在新藥開發(fā)、外排泵抑制劑等方面［1－3］，但新藥開發(fā)并不是控制耐藥性的有效手段，外排泵抑制劑研究距離實(shí)際應(yīng)用也有很大的距離。本文在前期研究發(fā)現(xiàn)，亞抑菌濃度黏菌素可以增加FQs對耐藥大腸桿菌抗菌作用的基礎(chǔ)上［4］，以亞抑菌濃度黏菌素處理大腸桿菌，探討其對外膜蛋白表達(dá)量及OF攝入量的影響，從而為大腸桿菌對喹諾酮類藥物耐藥性控制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 大腸桿菌質(zhì)控菌株ATCC25922，購自美國菌種保存中心；FQs耐藥株29－2，西南大學(xué)榮昌校區(qū)藥學(xué)教研室分離保存。硫酸黏菌素，含量98%，批號：0809051；氧氟沙星，含量99.4%，批號：200806023；均由重慶方通動物藥業(yè)有限公司提供。蛋白提取相關(guān)試劑，均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。Waters2695高效液相色譜儀，Empower色譜工作站，美國Waters公司。

1.2 色譜條件［5］Diamonsil C18柱（250nm×4.6 nm，5μm）；流動相：0.05mol／L枸櫞酸－乙腈（79∶21），用乙醇胺調(diào)節(jié)pH 值至4.0；流速：1.0mL／min；進(jìn)樣量：20μL；激發(fā)波長：295nm；發(fā)射波長：505nm；柱溫：40℃；Waters2475熒光檢測器。

1.3 黏菌素亞抑菌濃度的測定及細(xì)菌培養(yǎng) 采用臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（clinical and laboratory standards instituet，CLSI）推薦的瓊脂稀釋法測定黏菌素對受試菌的MIC，并以含1／2MIC黏菌素的LB培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)菌過夜。

1.4 外膜蛋白提取、含量測定及SDS－PAGE 參照 Kalle B（1989）的方法并改進(jìn)［6］。LB培養(yǎng)液培養(yǎng)至 OD600＝1A，30mmol／L Tris Cl（pH 值7.5）洗滌濕菌1次，精密稱取3.000 0g濕菌，40mL溶液（含冷30mmol／L Tris HCl、1mmol／L MgCl2、0.1 mg／mL DnaseⅠ、RnaseB，pH 值7.5）重懸，冰浴、超聲破碎，2 000r／min離心10min，去除未破碎細(xì)胞，取上清加入終濃度2%十二烷基肌酸鈉，20℃培養(yǎng)20min去除內(nèi)膜及非膜蛋白，100 000g冷凍離心1h去上清，蒸餾水溫和洗滌沉淀，1.1mL溶液（1%SDS、0.5mol／L NaCl、30mmol／L Tris HCl、10mmol／L EDTA，pH值7.5）溶解沉淀中的膜蛋白，超聲裂解2min，37℃培養(yǎng)30min，100 000r／min冷凍離心15min，上清為膜蛋白。分別于260 nm、280nm處測定蛋白樣品的吸光度，按照公式“蛋白濃度（mg／mL）＝1.450A280－0.740A260”計(jì)算蛋白含量［7］。對蛋白樣品進(jìn)行SDS－PAGE檢測，積層膠為5%，分離膠為8%，點(diǎn)樣量均為10μL／孔。電泳完畢后以考馬斯亮藍(lán)R250對凝膠染色，過夜，用脫色液（含30%甲醇，10%冰醋酸）脫色至蛋白條帶清晰為止。

1.5 細(xì)菌對OF的攝入動力學(xué)試驗(yàn)

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將 OF用0.1mol／L鹽酸甘氨酸（pH 值3.0）配成濃度為1×10－5、5×10－5、2×10－4、1×10－3、2×10－3、1×10－2、2×10－2mg／L和1×10－1mg／L，采用高效液相色譜熒光檢測法測定相應(yīng)峰面積后，繪制峰面積與OF含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.2 菌體內(nèi) OF 攝入量的測定［8］將29－2和ATCC25922分別接種于20mL LB肉湯培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)至指數(shù)生長中期（OD650＝0.7～0.8），4 000r／min（4℃）離心10min，收集菌體稱重，用50 mmol／L PBS（pH 值7.0）沖洗2次，PBS重懸細(xì)菌（使細(xì)菌濃度為40mg／mL），37℃溫浴10min；加Colisitin（0.25、0.125μg／mL）、OF（10μg／mL）于菌液中，分別在加入 OF后的10、30、60、120、180、300、600、900、1 500s時(shí)取樣（每管取0.25mL）；取樣后，立即加1.25mL預(yù)冷的PBS（同上），8 000r／min（4℃）離心5min，沉淀用緩沖液洗1次，同樣條件離心，棄上清，沉淀物加鹽酸甘氨酸緩沖液（0.1 mol／L，pH 值3.0）1mL，26℃水浴2h；離心沉淀，取上清液用高效液相進(jìn)行熒光檢測。

1.6 處理前后受試菌對OF的MIC 采用臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（CLSI）推薦的瓊脂稀釋法測定Sub－Colistin處理前后受試菌對OF的MIC，比較處理前后藥物敏感性變化。

2 結(jié)果

2.1 Sub－Colistin對受試菌OF MIC的影響 加入Sub－Colisitin后，質(zhì)控菌、耐藥菌對OF的敏感性升高1倍，見表1。

表1 受試菌的 MIC值（μg／mL）

2.2 外膜蛋白含量測定 見表2。

表2 外膜蛋白含量

2.3 SDS－PAGE結(jié)果 見圖1。

圖1 SDS－PAGE電泳結(jié)果

2.4 受試菌OF攝入量結(jié)果 見表3和圖2。

表3 受試菌OF攝入量

圖2 OF菌體攝入量結(jié)果

3 討論

喹諾酮類藥物必須進(jìn)入菌體內(nèi)部才能發(fā)揮作用，大腸桿菌外膜上與Qs轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的有兩個(gè)通道，分別稱為OmpF和OmpC，當(dāng)OMP表達(dá)量降低影響藥物轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)，細(xì)菌即可發(fā)生耐藥［7－8］，但 Hirai K 對大腸埃希氏菌norC突變株的研究表明，僅由膜通透性降低所引起的藥物蓄積濃度減少極其有限［9］。

本研究結(jié)果顯示，ATCC25922與OF耐藥菌29－2外膜蛋白有明顯差異，29－2外膜蛋白表達(dá)量低（試驗(yàn)條件下為0.0397mg／mL），電泳檢測沒有蛋白條帶顯示，說明29－2存在外膜蛋白表達(dá)降低的耐藥機(jī)制。Sub－Colistin處理后，29－2OMP表達(dá)量明顯增多，達(dá)到 25.52mg／mL，與黏菌素處理后ATCC25922的表達(dá)量相當(dāng)（20.45mg／mL），說明黏菌素可使29－2外膜蛋白表達(dá)量顯著增加，但具體原因尚無相關(guān)報(bào)道，有待深入研究。質(zhì)控菌黏菌素處理后，OMP量有所下降，可能與黏菌素本身抑菌作用有關(guān)。結(jié)合OF菌體攝入量分析，29－2的攝入量（1.21～2.79ng／mL）明顯低于ATCC25922（4.51～6.83ng／mL），與其對 OF的敏感性相符，Sub－Colistin處理后，2株細(xì)菌OF的攝入量均增加1ng／mL左右（見2.4），說明Sub－Colistin處理對于質(zhì)控菌及耐藥菌OF攝入量的影響差異不大，這也是2株細(xì)菌Sub－Colistin處理后OF的敏感性僅升高1倍（見2.1）的原因。上述結(jié)果表明，Sub－Colistin處理后，耐藥菌OMP表達(dá)量升高，但對大腸桿菌OF攝入量及敏感性的恢復(fù)作用有限，與Hirai K［9］報(bào)道相符。說明OMP表達(dá)量降低不是導(dǎo)致臨床分離多重耐藥大腸桿菌29－2對OF耐藥的決定原因。

［1］Zheng J，Cui S，Meng J.Effect of transcriptional activators RamA and SoxS on expression of multidrug efflux pumps AcrAB and AcrEF in fluoroquinolone－resistant Salmonella typhimurium［J］.Journal Antimicrob Chemother，2009，63（1）：95－102.

［2］O＇regan E，Quinn T，Pag SJM.Multiple regulatory pathways associated with high－level ciprofloxacin and multi－drug resistance in Salmonella enterica serovar enteritidis：in－volvement of RamA and other global regulators［J］.Antimicrob Agents Chemother，2009，53（3）：1080－1087.

［3］張志平.喹諾酮類抗菌藥研究的新進(jìn)展［C］／／第四屆全國喹諾酮類抗菌藥科研與臨床應(yīng)用研討會論文（摘要）匯編.成都：中國抗生素雜志社，2000：1－20.

［4］吳俊偉，楊俊卿.恩諾沙星與硫酸黏菌素聯(lián)合抗菌活性的研究［J］.西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，28（4）：558－561.

［5］Cattoir V，Lesprit P，Laseols C，etal.In vivo selection during ofloxacin therapy of Eseherichia coli with combined topoisomerase mutations that confer high resistance to ofloxacin but susceptibility to nalidixic acid［J］.Journal Antimicrob Chemother，2006，58（5）：1054－1057.

［6］Kalle B，Gehring S，Hiroshi N.Existence and Purification of Porin Heterotrimers of Escherichia coli K12OmpC，OmpF，and PhoE Proteins［J］.The Journal of Biological Chemistry，1989，264（5）：2810－2815.

［7］Lynch M J，Drusano G L，Mobley H L T.Emergency of resistance to Imipenem in pseudomonas aeruginosa［J］.Antimicrob Agents Chemother，1987，31（12）：1892－1896.

［8］Fabio F，Patricia N，Paula G，etal.Ciprofloxacin interactions with bacterial protein OmpF：Modelling of FRET from a multi－tryptophan protein trimer［J］.Biochimica et Biophysica Acta，2007，1768：2822－2828.

［9］Hirai K，Aoyama H，Suzue S，etal.Isolation and characterization of norfloxacin－resistant mutants of Escherichia coli K－12［J］.Antimicrob Agents Chemother，1986，30（2）：248.