X射線照射對(duì)體外培養(yǎng)仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖和睪酮分泌的影響

鄭小波，何 濤，肖 榕，卿利娟，吳 群，李 婧，葛 亮，鄭之琬

（1.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，重慶 榮昌402460；2.西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶 北碚400716）

睪丸間質(zhì)細(xì)胞（Leydig Cell，LC），分布于生精小管間的疏松結(jié)締組織中，是合成和分泌雄性激素的主要細(xì)胞［1］，大約95%的雄激素是由它合成和分泌的［2］，其分泌睪酮的能力取決于單個(gè)細(xì)胞的分泌功能和具有分泌功能細(xì)胞的數(shù)量［3］。從1895年11月8日德國物理學(xué)家威.康.倫琴發(fā)現(xiàn)X射線100多年來，X射線已用于醫(yī)療衛(wèi)生工作之中。但X射線對(duì)使用者和被使用者的危害不容忽視。國內(nèi)外許多文獻(xiàn)報(bào)道了X射線與生殖細(xì)胞的相關(guān)性研究。但是很少報(bào)道X射線對(duì)性激素生成的影響。豬的睪酮分泌方式與人相似，而且仔豬未成熟的間質(zhì)細(xì)胞在體外能保持較長(zhǎng)時(shí)間的分泌功能，能更好推測(cè)X射線對(duì)人睪酮分泌的影響。因此本試驗(yàn)以仔豬為材料，利用體外培養(yǎng)方法，通過不同放射劑量X射線照射睪丸間質(zhì)細(xì)胞，測(cè)定睪酮含量變化，同時(shí)利用MTT法觀察X射線照射對(duì)仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖的影響，從而為探討X射線對(duì)人體生殖影響及其防護(hù)提供新的試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 1640培養(yǎng)基（GIBCO），hCG、牛血清白蛋白（BSA）、I型膠原酶（Sigma公司），睪酮 ELISA 檢測(cè)試劑盒（ADL）、MTT、DMSO，X射線機(jī)（PLX100）。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 3周齡長(zhǎng)白仔豬，采自重慶畜牧科學(xué)研究院。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 無菌條件下采集3周齡的仔豬睪丸，放入盛有雙抗的冰浴PBS中，并迅速送回實(shí)驗(yàn)室。進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)室，酒精擦拭睪丸表面，并用含雙抗的PBS清洗3次，剝離被膜，分離出睪丸間質(zhì)細(xì)胞，將睪丸組織剪碎為1 mm大的小塊。1 000r／min離心5min，棄上清，加入PBS稀釋，重復(fù)離心3次。在37℃下，不完全培養(yǎng)基中，膠原酶消化液消化90min，1 000r／min離心5min，留沉淀。將沉淀用PBS進(jìn)行稀釋，1 000 r／min離心5min，留沉淀。用培養(yǎng)液溶解沉淀，移液槍輕輕吹打，使其分散成為單細(xì)胞，再用200目細(xì)胞篩過濾，濾液用苔盼藍(lán)染色，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果將間質(zhì)細(xì)胞濃度調(diào)整至1×108細(xì)胞／mL，37℃，5%CO2，飽和濕度下培養(yǎng)。培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行3β－HDS酶活檢測(cè)［4］.

1.3.2 照射劑量的處理 根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果將間質(zhì)細(xì)胞稀釋至1×108細(xì)胞／mL，37℃，5%CO2，飽和濕度下培養(yǎng)48h，將培養(yǎng)的細(xì)胞分為5個(gè)試驗(yàn)組和一陰性對(duì)照組，各組均加入50IU／mL的hCG［5］，再給予試驗(yàn)組不同劑量的X射線照射［6］，試驗(yàn)組照射劑量分別為54kvp、6.4mAs、84.86μGy，66kvp、2.5 mAs、75.83μGy，62kvp、3.2mAs、63.16μGy，73 kvp、1.6mAs、49.96μGy，84kvp、1.0mAs、43.12 μGy，陰性對(duì)照組照射劑量為零，X射線發(fā)射器與培養(yǎng)物的距離設(shè)為150cm，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3.3 照射時(shí)間的處理 根據(jù)1.3.2的培養(yǎng)方法，將培養(yǎng)的細(xì)胞分為3個(gè)試驗(yàn)組和一陰性對(duì)照組，各組均加入50IU／mL的hCG，選擇63.16μGy為試驗(yàn)組照射不同時(shí)間的X射線，照射時(shí)間分別為0，5，15，30min。

1.3.4 不同時(shí)間和劑量的X射線影響仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞的增殖 加入180μL細(xì)胞培養(yǎng)液于96孔板中，使待測(cè)細(xì)胞密度為10 000～100 000細(xì)胞／孔，細(xì)胞培養(yǎng)及處理方法同1.3.2和1.3.3，培養(yǎng)48h后分別予以50IU／mL的hCG及不同劑量的X射線照射如表1，每個(gè)劑量3個(gè)重復(fù)。再培養(yǎng)20h后，各組同時(shí)加入5g／L的 MTT 20μL；37℃，培養(yǎng)4h；吸去 MTT，加150μL DMSO，37℃，反應(yīng)15min，酶標(biāo)儀于450nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度（A）值。抑制率（IR）%＝（A對(duì)照組－A試驗(yàn)組）／A對(duì)照組×100%。以抑制率大于30%為敏感［5］。

1.3.5 不同時(shí)間和劑量的X射線影響仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌 按1.3.2和1.3.3的培養(yǎng)方法及處理方法所得的細(xì)胞在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)24h，1 000r／inm離心5min，收集培養(yǎng)液，待測(cè)。取出酶標(biāo)板，依次加入50μL的標(biāo)準(zhǔn)品于空白微孔中；標(biāo)記樣品編號(hào)，并加入50μL樣品于空白微孔中；在標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔中各加入100μL的酶標(biāo)記溶液；37℃孵育反應(yīng)1h；用1∶20的濃縮洗液與醫(yī)用蒸餾水稀釋液清洗酶標(biāo)板5次，每次靜置10～20s；再每孔加入底物A、B液各50μL；并在37℃下避光孵育反應(yīng)15min；每孔加入50μL終止液，終止反應(yīng)。在波長(zhǎng)450nm的酶標(biāo)儀上測(cè)定OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線得出各個(gè)劑量下的睪酮濃度值（相關(guān)系數(shù)0.812）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SSPS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量指標(biāo)滿足條件用單因素方差分析，再進(jìn)行q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量X射線對(duì)仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖的影響 將仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞按1.3.2培養(yǎng)及處理后，利用1.3.4的方法，觀察不同劑量X射線照射對(duì)LC增殖的影響，結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞對(duì)各個(gè)照射劑量均敏感，各劑量對(duì)細(xì)胞增殖抑制率無明顯差異（圖1）。

圖1 不同劑量的X射線照射對(duì)仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖抑制情況

2.2 不同時(shí)間X射線照射對(duì)仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖的影響 將仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞按1.3.3培養(yǎng)及處理后，利用1.3.4的方法，觀察不同時(shí)間X射線照射對(duì)LC增殖的影響，結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞，在63.16μGy劑量下照射5、15、30min，各組LC增殖均受到抑制，且抑制率隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸上升（圖2）。

圖2 不同時(shí)間X射線照射對(duì)仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖抑制情況

2.3 不同劑量X射線對(duì)仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌量的影響 將仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞按1.3.2培養(yǎng)及處理后，采用1.3.5的方法，利用睪酮ELISA檢測(cè)試劑盒，測(cè)定睪酮的分泌量。結(jié)果表明，在試驗(yàn)組設(shè)定的照射劑量下的睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌量與對(duì)照組相比有一定的減少，但差異不顯著（P＞0.05）（圖3）。

圖3 不同劑量的X射線照射后仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌情況

2.4 不同劑量X射線對(duì)仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌量的影響 將仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞按1.3.3培養(yǎng)及處理后，采用1.3.5的方法，利用睪酮ELISA檢測(cè)試劑盒，測(cè)定睪酮的分泌量。結(jié)果顯示，在63.16 μGy劑量下5min，體外培養(yǎng)睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌量與對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05），而照射15、30min，睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌量與對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05）（圖4）。

3 討論

X射線是具有一定波長(zhǎng)和頻率，光子能量較大的一種電磁波。X射線可能使物質(zhì)發(fā)生電離，其屬于不可見光，不帶電，通過三棱鏡時(shí)不會(huì)發(fā)生折射。性腺既具有生殖功能也具有內(nèi)分泌功能，其對(duì)電離輻射較為敏感。輻射對(duì)性腺的影響可引起不育、性細(xì)胞突變、子代異常等。睪丸具有生成精子、分泌睪酮的功能。有報(bào)道，男性全身或局部受一定劑量的輻射后，可能會(huì)出現(xiàn)精子數(shù)量減少及精子活力降低、畸形精子增多，無論是大劑量事故照射或小劑量職業(yè)照射都可致性腺損害，從而影響生育［7］。電磁波輻射可影響cAMP蛋白激酶的活性降低，也可能降低細(xì)胞內(nèi)多種酶的活性，當(dāng)這些酶活性降低就可能會(huì)引起細(xì)胞增殖停止。據(jù)報(bào)道［8］，輻射可使中國倉鼠V79細(xì)胞克隆減少，而無法進(jìn)入S期，這一現(xiàn)象與輻射的功率和暴露時(shí)間有關(guān)，電磁波輻射也可對(duì)細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)構(gòu)和合成造成一定的影響，從而影響細(xì)胞增殖。而X射線本質(zhì)就是一種電磁波，所以試驗(yàn)中仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖也有可能受到抑制。而長(zhǎng)期低強(qiáng)度電磁脈沖作用，可通過積累效應(yīng)使細(xì)胞膜形成電穿孔［9］，從而影響細(xì)胞的活性，使細(xì)胞的增殖能力降低。本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)的各劑量X射線對(duì)細(xì)胞增殖均有抑制作用，所以長(zhǎng)期從事X射線操作的工作人員以及被操作人員都應(yīng)該做好防護(hù)。

圖4 不同時(shí)間X射線照射后仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌情況

X射線可影響睪丸間質(zhì)細(xì)胞的增殖，而睪丸間質(zhì)細(xì)胞主要功能就是分泌睪酮，人體血液循環(huán)中最重要的雄激素為睪酮［10］。據(jù)報(bào)道［11］，人體受50～100Gy照射后的睪丸仍能對(duì)垂體促性腺激素起反應(yīng)，0.75～6Gy照射人體的睪丸，血清睪酮的濃度無明顯變化。而本次試驗(yàn)的X射線的照射劑量中的最大劑量為84.86μGy，各個(gè)輻射劑量下所分泌的睪酮量與對(duì)照組的分泌量差異不顯著（P＞0.05），一次試驗(yàn)劑量對(duì)睪酮分泌的影響不大，所受到的輻射水平很低，因而對(duì)性及內(nèi)分泌功能不會(huì)造成較大的影響。值得注意的是長(zhǎng)時(shí)間低劑量的電磁脈沖，具有積累效應(yīng)［9］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著輻射時(shí)間延長(zhǎng)間質(zhì)細(xì)胞增殖的抑制顯著增加，而睪酮分泌則顯著下降，這與牟翔［12］等的研究結(jié)果是一致的。故長(zhǎng)時(shí)間使用X射線對(duì)畜體和人體還是存在安全隱患。所以在使用X射線診斷和治療疾病時(shí)，操作者和被操作者都應(yīng)注意必要的防護(hù)。

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