絨山羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)試驗

彭松旺 毛常生

（迪慶藏族自治州德欽縣燕門鄉(xiāng)獸醫(yī)站，德欽 674506）

絨山羊母羔卵母細胞在體外成熟過程中，成熟培養(yǎng)液中添加12 mg/ml的進口牛血清白蛋白（BSA）可以替代血清培養(yǎng)液，即含10%胎牛血清（FBS）的培養(yǎng)液，并不影響卵母細胞最終成熟。絨山羊母羔卵母細胞體外成熟后的核成熟率可達到55%左右，但其胞質成熟的質量與成年羊的卵母細胞相比有較大差距。

1 材料與方法

1.1 卵巢來源

成年母羊：3～4歲、健康、空懷的絨山羊。母羔：4～8周齡、體況良好、未斷奶的絨山羊母羔。

1.2 主要試劑

促卵泡素（FSH）（寧波第二激素廠，批號：080127）；FSH（加拿大產，批號：081113），PMSG（1 000 IU/支，寧波市三生藥業(yè)有限公司，批號：090111）；發(fā)情羊血清（ESS）（絨山羊發(fā)情當天用常規(guī)血清制備法自制，56℃滅活處理30 min）。TCM199（M5017），EG（E-9129），透明質酸酶（hyaluronidase）（H-3506），其他試劑除特殊說明外均購自Sigma公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 母羔超數(shù)排卵與手術方法

將試驗供體幼羔分組，20：00開始第1次激素注射，間隔12 h第2次注射，以此類推，總計注射4次。一般在最后6～10 h 1針結束后開始采卵手術。為保證準確查數(shù)卵巢表面的卵泡及抽取卵母細胞，采用摘取卵巢的方式。

1.3.2 成年羊卵巢采集

采集剛屠宰的絨山羊新鮮卵巢，立即放入裝有含雙抗（青霉素、鏈霉素各200 IU/ml）的37℃～39℃生理鹽水保溫瓶中，1h內運回實驗室無菌操作間。到達實驗室后，卵巢立即用39℃無菌生理鹽水沖洗3次再用含3 mg/ml的39℃的PBS液（取卵液）洗1次。

2 結果與分析

2.1 不同體重的羔羊卵泡發(fā)育及回收卵的比較

對出生后30～60 d的羔羊采用相同的方法分別進行超數(shù)排卵，術中記錄2側卵巢的發(fā)育卵泡數(shù)量，活體抽吸采卵后，從發(fā)育卵泡比較，4.5～5.5 kg組平均為125.6±46.1枚，顯著高，7.6～9.5 kg組（P<0.05）。各組卵母細胞回收的數(shù)量和回收率差異不顯著（P<0.05）。5.6～7.5 kg組每只羔羊平均可用于體外培養(yǎng)的卵母細胞為54.4±13.3枚，顯著高，9.6～11.5 kg組的36.4±9.7枚（P<0.05）。而可用卵比率，4.5～5.5 kg、5.6～7.5 kg、7.6～9.5 kg組與組間差異顯著（P<0.05）。顯然，回收率與可用卵比率不成正比。說明體重在4.5～7.5 kg的母羔對超排激素反應最敏感，而體重在5.6～7.5 kg階段的母羔可提供的有效卵母細胞的數(shù)量最多。

2.2 超排激素和劑量不同對母羔卵泡發(fā)育和體外成熟的影響

對34只羔絨山羊采用4種超排方案進行超數(shù)排卵，對比卵泡發(fā)育、回收卵數(shù)量及成熟效果，4種超排方案采卵結果顯示，采卵后，觀察到的卵泡發(fā)育和具有卵丘細胞的A、B卵平均數(shù)量分別為59.7±23.2、98.0±25.2、72.7±14.8、107.4±42.0枚和46.1±12.4、64.8±19.0、54.5±6.8、61.6±20.8枚，卵巢表面卵泡的發(fā)育數(shù)量以Ⅳ組最高，與未注PMSG的Ⅰ組差異顯著（P<0.05）。各組回收的卵和可用的卵母細胞差異不顯著（P<0.05）。個體平均的卵母細胞成熟數(shù)量Ⅱ組顯著高于Ⅰ組（P<0.05），而卵母細胞的體外成熟率，Ⅲ組與Ⅳ組差異顯著（P<0.05）表明在超數(shù)排卵的最后1針，加注可增加PMSG卵巢內卵母細胞的發(fā)育數(shù)量。在超排第1針加注PMSG可以提高卵母細胞的體外成熟率。由于個體間對激素超排反應差異較大，在卵母細胞的回收數(shù)量方面各組間差異并不顯著。

2.3 絨山羊幼羔卵母細胞與成年羊卵母細胞體外成熟能力的比較

山羊母羔卵母細胞與成年羊卵母細胞體外成熟能力的比較結果見表1。由表1可知，母羔卵母細胞極體，55.4%，顯著低于成年羊的70.6%（P<0.05），成年卵母細胞的體外成熟能力明顯優(yōu)于羔羊。

表1 山羊母羔卵母細胞與成年羊卵母細胞體外成熟能力比較

3 討論

3.1 母羔體重與卵泡發(fā)育的關系

本試驗結果表明，超排母羔的體重與超排效果之間的關系，即絨山羊母羔體重在4.5～5.5 kg間對超排激素反應最敏感，可獲得最大程度的卵泡發(fā)育數(shù)量，但卵丘細胞少于3層的卵母細胞與裸卵的比例也明顯增加，說明卵泡液中缺乏卵母細胞發(fā)育前期的生長因子，使可利用的卵母細胞數(shù)量大幅下降。原始卵泡構成出生后卵巢生殖細胞庫，其數(shù)量隨動物種類而異，隨年齡增加而下降。試驗結果發(fā)現(xiàn)，隨著羔羊日齡及體重的增加，卵巢表面的卵泡發(fā)育數(shù)量有逐漸減少的趨向，而卵泡內完整的卵丘卵母細胞的比例也在提高，也驗證了上述理論。盡管同一體重階段個體對超排反應的差異較大，但獲得較理想的超排效果可選擇體重為5.69～7.5 kg，5～6周齡的羔羊。

3.2 超排激素對母羔卵泡發(fā)育和卵母細胞體外成熟的影響

激素誘導超數(shù)排卵的方法能使幼畜卵泡發(fā)育、排卵和受精，但是以往幼畜卵泡發(fā)育研究的結果都不大理想，幼畜超排后的排卵率低、異常卵多、受精率和發(fā)育率也都低。其原因是幼畜的生殖道尚未完全成熟，缺乏精子運行獲能及胚胎發(fā)育的適宜環(huán)境。進口促卵素的超排效果穩(wěn)定，且卵母細胞的體外成熟率較高。本試驗結果證實，在超排方案中加入PMSG，可提高超排效果，并有利于卵母細胞的體外成熟。考慮這與PMSG具有FSH和LH的雙重功效有關，在增加卵泡發(fā)育數(shù)量的同時，又能夠為卵母細胞的成熟提供必要的相關因子。首次，注射PMSG更有利于成熟因子在卵泡液中的積累，使卵母細胞的成熟率相對得到提高。最后增加注射PMSG可使個體平均成熟的卵母細胞增加，可在實際操作中使用。盡管國產超排激素可使幼齡母羔卵巢發(fā)育的卵泡數(shù)量最多，但效果不夠穩(wěn)定，個體間的差異較大，且卵母細胞的體外成熟率明顯低于進口FSH的方案，這可能與FSH的純度有關。

3.3 不同培養(yǎng)液對山羊母羔卵母細胞體外成熟效果的影響

盡管含血清的培養(yǎng)液已被廣泛地接受和應用于動物細胞的體外培養(yǎng)，但由于血清成分復雜，存在許多未知因素。本研究結果顯示，在山羊母羔卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液中分別添加1、4、8和12 mg/ml BSA，其成熟率分別為53.8%、58.7%、57.5%、61.3%，說明在一定范圍內山羊卵母細胞的成熟率隨著BSA添加量的增加而相應提高。已有資料表明，卵母細胞在無血清培養(yǎng)液成熟并受精，且成熟率和受精率分別達到85.14%和83.57%因而，血清并不是體外培養(yǎng)必不可少的，本試驗也證實了這一推測，在絨山羊卵母細胞的體外成熟方面是可行的。

4 結束語

綜上所述，本文簡述了幼齡母羊超排是利用外源激素誘導卵泡發(fā)育，以提高所獲卵母細胞數(shù)量及其體外成熟能力，可充分挖掘優(yōu)秀個體的繁殖性能。受遺傳、營養(yǎng)、環(huán)境等因素的影響，母羔對激素反應是有差異的。絨山羊母羔超排的效果如何，至今尚無報道。鑒于此本試驗研究了不同體重、超排方案對母羔所獲卵母細胞效果的影響，比較了羔羊與成年羊卵母細胞體外成熟差異，為建立絨山羊母羔早期繁殖利用技術提供參考依據。