體外法研究阿卡波糖對模擬瘤胃酸中毒的調(diào)控作用

王方園 李 艷

（山東省萊西市畜牧獸醫(yī)局，萊西 266600）

阿卡波糖是一類目前在人類醫(yī)學(xué)上用于治療Ⅱ型糖尿?。ǚ且葝u素依賴型）的藥物，其作用機(jī)制為通過抑制淀粉酶和葡萄糖苷酶的酶活性而減緩單糖的生成速度（高慧君，1997）。最近2年陸續(xù)有報道表明，該物質(zhì)也可用于提高奶牛瘤胃中的pH值，防止急性酸中毒的發(fā)生（McLaughlin 等，2009A；McLaughlin 等，2009B）。為初步了解阿卡波糖在高精料條件下對瘤胃微生物的發(fā)酵的影響，進(jìn)一步解明上述問題。本試驗通過體外發(fā)酵技術(shù)，在前人基礎(chǔ)上，體外研究了阿卡波糖對山羊瘤胃微生物發(fā)酵活力的影響，擬進(jìn)一步為阿卡波糖在反芻動物上的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、動物飼養(yǎng)及瘤胃液的獲取

阿卡波糖由德國拜耳公司生產(chǎn)，純度為99%。

本試驗選用兩頭裝有永久性瘤胃瘺管的本地成年公山羊，單圈飼喂，以玉米、豆粕和羊草為主的精粗比例為4∶6的日糧預(yù)飼1周，按每天8：00和20：00飼喂，自由飲水。試驗當(dāng)日，于飼喂后2 h分別從2頭山羊的瘤胃內(nèi)抽取瘤胃內(nèi)容物，放入充滿CO2的塑料管內(nèi)。將所獲取瘤胃液經(jīng)過4層紗布過濾以后取相同的體積在厭氧條件下攪拌30 s混勻，而后與培養(yǎng)基混合，比例為培養(yǎng)基∶瘤胃液為9∶1。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配方及制作

配方：292 mg K2HPO4、240 mg KH2PO4、480 mg（NH4）2SO4、480 mg NaCl、100 mg MgSO4·7H2O、64 mg CaCl2·2H2O、4 000 mg Na2CO3、600 mg半胱氨酸鹽酸，加水至1 L，通CO2至完全厭氧，加入瘤胃液，混合均勻后，厭氧條件下定量（40 ml/瓶）分裝至含底物的發(fā)酵瓶中，用橡皮塞和鋁蓋密封，放至39℃水浴中發(fā)酵。

1.2.2 試驗設(shè)計

試驗設(shè)置空白組和試驗組，試驗組中的阿卡波糖添加量分別為0 mg、4 mg、8 mg、16 mg。空白組除不添加底物和阿卡波糖外，其他與各處理相一致，各組均設(shè)置4個重復(fù)，底物為0.8 g粉碎的玉米和0.2 g粉碎的羊草（過40目的篩）。每瓶接種40 ml培養(yǎng)基和瘤胃液混合液，39 ℃下培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)期間，每隔3 h用氣壓計平衡氣壓以保證發(fā)酵的正常進(jìn)行，發(fā)酵至終點(diǎn)后，冰浴終止發(fā)酵，立即測定pH值，并收集上清液，凍存于－20℃冰箱內(nèi)，備測氨氮、乳酸和揮發(fā)性脂肪酸（VFA）等。

另在試驗中準(zhǔn)備相同試驗組研究阿卡波糖對發(fā)酵動力學(xué)的影響，用氣壓轉(zhuǎn)換儀定時測定瓶內(nèi)產(chǎn)氣量（2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h、48 h、72 h）。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel（2003）初步處理之后，結(jié)果分析采用SPSS（16.0）統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加阿卡波糖對發(fā)酵體系中pH、VFA和乳酸的影響

添加阿卡波糖對發(fā)酵體系中各項指標(biāo)的影響，詳見表1。

表1 添加阿卡波糖對體外發(fā)酵系統(tǒng)常規(guī)指標(biāo)的影響情況

由表1可見，試驗結(jié)果表明，與未加阿卡波糖的對照相相比，添加阿卡波糖的各處理組均顯著提高了發(fā)酵液pH值、乙丙比、異丁酸和戊酸產(chǎn)量（P＜0.01），顯著降低了乳酸、乙酸、丙酸、丁酸和TVFA產(chǎn)量（P＜0.01），但對異戊酸濃度無顯著影響（P=0.794）

2.2 阿卡波糖對累積產(chǎn)氣量和總產(chǎn)氣量的影響

如圖1所示：在接種后24 h內(nèi)，各阿卡波糖處理組的累積產(chǎn)氣量顯著低于對照組（P＜0.001）。但在接種后72 h內(nèi)，添加4 mg的阿卡波糖處理組的累積產(chǎn)氣量顯著高于對照組（P＜0.001），而8 mg組的累積產(chǎn)氣量與對照組大致相當(dāng)，但其呈進(jìn)一步上升趨勢，添加16 mg阿卡波糖的處理組低于對照組（P＜0.001）。

圖1 累積產(chǎn)氣量變化圖

3 討論

阿卡波糖作用機(jī)制是通過抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的酶活性減緩單糖的生成速度（高慧君，1997）。在瘤胃微生物發(fā)酵多糖類飼料時，首先需要通過自身分泌的α-淀粉酶和α-糖苷酶對多糖進(jìn)行降解，形成單糖，供自身生長需要。本研究結(jié)果顯示，添加阿卡波糖可有效提高發(fā)酵液pH值，顯著降低乳酸及VFA產(chǎn)量，結(jié)果說明阿卡波糖可有效的抑制瘤胃微生物活力，結(jié)合其在人類醫(yī)學(xué)上治療Ⅱ型糖尿病的作用機(jī)制，我們推測，其可能機(jī)制是通過抑制瘤胃微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)α-糖苷酶和α-淀粉酶的酶活力，進(jìn)而減緩瘤胃微生物對多糖的酶解速度，從而有效的阻止瘤胃pH值的快速下降。

Speight等（2010）體外研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，添加1.2～9.5 mg的阿卡波糖能有效阻止pH的下降以及VFA的積累。本試驗結(jié)果表明，添加阿卡波糖后，乙酸、丙酸、丁酸均顯著降低，并顯著減少了TVFA產(chǎn)量，增加了乙丙比例，本試驗結(jié)果與上述報道基本一致。Marta和Alex（2010）研究發(fā)現(xiàn)，在高產(chǎn)泌乳奶牛日糧中添加0.75 g/d的阿卡波糖能有效地減少瘤胃pH＜5.6的持續(xù)時間，乳酸產(chǎn)生菌牛鏈球菌和乳酸利用菌埃氏巨型球菌比例減小。本試驗研究結(jié)果表明，較總揮發(fā)性脂肪酸相比，阿卡波糖在降低乳酸含量（下降比例高于92%）上的結(jié)果更為顯著，由于乳酸是反芻動物急性酸中毒的主要因素，并主要由牛鏈球菌及乳酸桿菌等發(fā)酵生成。結(jié)論：高精料條件下，阿卡波糖可能主要通過抑制牛鏈球菌的發(fā)酵活力來減少乳酸生成，從而阻此乳酸的大量累積。

本試驗結(jié)果顯示，與對照組相比，接種后24 h內(nèi)，添加阿卡波糖的各組的累積產(chǎn)氣量顯著降低，而接種后72 h總產(chǎn)氣量結(jié)果顯示，與對照組相比，添加4 mg阿卡波糖時的總產(chǎn)氣量高于對照組，8 mg時與對照組相近，而16 mg時總產(chǎn)氣量則低于對照組。該結(jié)果說明，阿卡波糖對瘤胃微生物作用效果與發(fā)酵時間有一定關(guān)聯(lián)，暗示阿卡波糖可能被瘤胃微生物降解，而降解產(chǎn)物可能不具有抑制淀粉酶和葡萄糖苷酶的酶活力的作用；同時該結(jié)果也提示，瘤胃微生物對阿卡波糖可能有一個適應(yīng)效應(yīng)，因此，其在預(yù)防瘤胃酸中毒方面是否具有持續(xù)效應(yīng)，目前尚不清楚。

綜上可知，添加阿卡波糖可有效提高瘤胃pH值，降低24 h內(nèi)瘤胃微生物產(chǎn)乳酸和VFA產(chǎn)量，減緩瘤胃微生物的產(chǎn)氣速率，有預(yù)防瘤胃酸中毒的潛力，但其作用機(jī)理及其持續(xù)效應(yīng)方面的研究尚需進(jìn)一步深入。