TaqMan探針結合COLD－PCR原理定量檢測JAK2V617F突變率研究

梁國威，邵冬華，曹清蕓，王樹琴，王新華，徐雪松

（1.航天中心醫(yī)院 檢驗科，北京100049；2.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春130033）

2005年多個研究組同時發(fā)現(xiàn)JAK2V617F（JAK2蛋白酪氨酸激酶基因）第1849位點突變（G＞T）與骨髓增殖性疾?。∕PDs）有關，該突變可明顯導致真性紅細胞增多癥（PV）、特發(fā)性血小板增多癥（ET）和骨髓纖維化（IMF）的發(fā)生和發(fā)展［1－5］。2008年世界衛(wèi)生組織（WHO）將JAK2V617F突變納入到上述疾病的診斷標準中［6］。由于JAK2 V617F是獲得性造血干細胞突變，骨髓和外周血中JAK2V617F呈不同細胞系的突變。Xu X［7］等報道在37例非MDPs診斷的JAK2V617F患者中，有25例JAK2V617F突變率小于5%，因此，對于JAK2V617F檢測方法的敏感性，特別是少量突變克隆株的檢測，顯得尤為重要。

2008年，LI等［8］報道較低變性溫度下復合擴增聚合酶鏈反應（COLD－PCR）可顯著提高少量突變的檢出率。其中快速COLD－PCR適用于變性溫度（Tc）值降低的突變，其原理是（1）任何一段DNA序列都有其嚴格、特定的Tc值，Tc值不同可致擴增效率產生巨大差異；（2）當PCR反應的Tc值設定在突變（如G：C＞A：T；G：C＞T：A等）DNA序列時，由于該Tc值低于野生型DNA片段，導致PCR擴增中野生型DNA片段的雙鏈大部分不能完全打開，而該Tc值可使得突變型DNA片段大部分雙鏈打開，由此即可實現(xiàn)對突變型DNA片段進行富集，然后進行分析。

由于JAK2V617F突變是G＞T點突變，適合快速COLD－PCR方法，因此，本研究采用TaqMan／MGB突變探針作為突變堿基的指示信號，結合快速COLD－PCR原理，建立高敏感性的在外周血基因組DNA中定量檢測JAK2V617F的突變率的Taq－Man－COLD－PCR方法。

1 材料與方法

1.1 純合野生、純合突變和外周血基因組DNA提取 采用天根生化科技（北京）有限公司的血液、細胞、組織基因組DNA提取試劑盒（目錄號：DP304－02），按試劑盒說明操作。提取的基因組DNA在－80℃凍存?zhèn)溆?。其中純合JAK2V617F突變細胞株（HEL，人紅白細胞白血病細胞，購自中國科學院細胞庫）經細胞培養(yǎng)至指數(shù)增長期后，提取基因組DNA；純合野生（健康志愿者）和患者EDTA抗凝外周全血200μl用于基因組DNA提取。

1.2 質粒標準品的制備和基因組DNA濃度校準采用特異引物分別擴增純合突變和純合野生JAK2基因中第13外顯子至第14－15間內含子共計1 818 bp，按常規(guī)方法構建JAK2V617F野生和突變質粒標準品，構建的質粒標準品經測序確認，并根據(jù)重組質粒分子量將質粒標準品換算并稀釋成1×109～1×105拷貝數(shù)／ml。以質粒標準品作為實時熒光定量PCR檢測標準曲線，將提取的HEL細胞株、健康志愿者和患者外周血基因組DNA的濃度校準為5.0×107拷貝數(shù)／ml。

1.3 JAK2V617F突變率標準品配制 將濃度為5.0×107拷貝數(shù)／ml的健康志愿者基因組DNA作為稀釋基質，加入同等濃度的HEL細胞基因組DNA，進行濃度梯度稀釋，配制成100%－0.1%的JAK2V617F突變標準品。

1.4 TaqMan－COLD－PCR引物和探針 上游引物：5′－TTG AAG CAG CAA GTA TGA TGA GC－3′；下游引物：5′－AGA AAG GCA TTA GAA AGC CTG TAG T－3′（由北京賽百盛基因技術有限公司合成）。TaqMan／MGB突變探針：與突變堿基匹配（其中下劃線堿基是突變堿基），5′－FAM－TCC ACA GAA ACA TAC－MGBNFQ－3′；TaqMan／MGB通用探針：避開突變堿基，其與突變和野生皆可完全匹配，5′－VIC－ACA TAC TCC ATA ATT TA－MGBNFQ－3′，TaqMan／MGB探針由美國ABI公司合成。

1.5 檢測儀器和反應體系構成 20μl反應體系，包括Taqman GT Master Mix 2×（購自美國ABI公司，目錄號：4371355）10μl，探針1μl（終濃度0.25μM），上、下游引物各2μl（終濃度分別是0.2 μM），模板2μl（濃度5.0×107拷貝數(shù)／ml），水2 μl。其中，濃度校準和選擇TaqMan－COLD－PCR 的Tc值時，采用TaqMan／MGB通用探針；檢測JAK2 V617F突變率的標準曲線和標本檢測采用Taq－Man／MGB突變探針。濃度校準儀器采用7500Real－Time PCR系統(tǒng)（美國ABI公司 ）；TaqMan－COLD－PCR Tc值的選擇和檢測方法建立采用Rotor－Gene Q real－time PCR分析系統(tǒng) （美國QIAGEN公司）。

1.6 擴增條件 TaqMan－COLD－PCR Tc值的選擇：（1）95℃，10min；（2）95℃－76℃，15s，62℃，40 s（讀熒光值），50個循環(huán)，以確定最佳Tc值。JAK2 V617F突變率檢測：（1）95℃，10min，（2）95℃，15 s；62℃，40s；8個循環(huán)，（3）79.0℃，15s；62℃，60s（讀熒光值）；50個循環(huán)。

1.7 臨床標本檢測 共計9例患者，其中真性紅細胞增多癥患者（PV）8例，骨髓纖維化患者（IMF）1例，采用建立的 TaqMan－COLD－PCR方法檢測JAK2V617F突變率，測序確認。

1.8 統(tǒng)計學方法 JAK2V617突變率與循環(huán)閾值（Ct值）間的相互關系和定標曲線的建立采用直線回歸分析，采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，以P＜0.05作為差別有顯著性的標準。

2 結果

2.1 選擇 TaqMan－COLD－PCR 的Tc值 分別以5.0×107拷貝數(shù)／ml濃度的人HEL細胞株和健康志愿者外周血基因組DNA作為模板，以TaqMan／MGB通用探針作為檢測信號，逐漸降低變性溫度，由95.0℃降至78.7℃。根據(jù)以下原則確定Taq－Man－COLD－PCR的Tc值：（1）突變和野生反應體系擴增曲線的Ct值差別最大；（2）突變反應體系的擴增效率最佳；最終確定TaqMan－COLD－PCR的Tc值是79.0℃，見圖1。

2.2 TaqMan－COLD－PCR檢測JAK2V617F突變率標準曲線的建立 將Tc值設定為79.0℃，將濃度5.0×107拷貝數(shù)／ml的含有100%、10%、1%和0.1%的JAK2V617突變的標準品同時重復測定2次。結果顯示，檢測突變率的下限是0.1%，JAK2突變率的對數(shù)值與Ct值間呈線性關系，線性回歸分析顯示：r＝0.993，P＜0.001，線性回歸方程是：y＝－0.196x＋4.186。因此，根據(jù)測定的患者標本Ct值，通過回歸方程計算即可獲得該患者JAK2 V617F突變率，計算公式是：JAK2V617F突變率＝10（4.186－0.196×Ct值）。見圖2。

圖1 TaqMan－COLD－PCR選擇Tc值的擴增曲線圖

2.3 TaqMan－COLD－PCR方法檢測患者標本結果

測定體系包括100%－0.1%突變率標準品和100%野生純合標準品作為陰性對照，采用建立的TaqMan－COLD－PCR方法對9例患者標本進行檢測，擴增曲線見圖3。測定的9例患者中，真紅8例，骨髓纖維化1例，8例真紅中的6例患者JAK2 V617F突變率為18.5%－50.9%，2例真紅和1例骨髓纖維化患者JAK2突變率為陰性。

圖2 TaqMan－COLD－PCR檢測JAK2V617F突變率PCR擴增曲線圖和定標曲線圖

圖3 TaqMan－COLD－PCR測定9例患者標本擴增曲線圖

2.4 患者標本測序結果

將9例患者標本通過常規(guī)PCR擴增后測序（擴增條件和引物同質粒標準品的制備），結果顯示，TaqMan－COLD－PCR與測序結果全部符合。見圖4。

3 討論

本研究采用TaqMan／MGB探針作為檢測信號，結合COLD－PCR擴增原理，成功建立了在外周血中定量檢測JAK2V617F突變率的TaqMan－COLD－PCR方法，該方法通過測定患者外周血基因組DNA的Ct值，再根據(jù)突變率與Ct值的標準曲線回歸方程，計算該測定標本中JAK2V617F的突變率。所建立 TaqMan－COLD－PCR 檢測方法 可 對JAK2V617F突變率進行定量檢測，并具有高突變檢測敏感性、高通量檢測、快速和無污染等特點，由于采用外周血標本進行檢測，還具有操作簡單的特點。

本研究建立的JAK2V617F突變率檢測方法的檢測下限是0.1%，明顯優(yōu)于其它JAK2V617F的檢測方法。文獻報道，DNA直接測序方法檢測突變率的下限為20%［3］；等位基因特異PCR方法 敏感性為1%－3%［9］；熒光定量PCR－ARMS原理和溶解曲線方法的敏感性為1%［10，11］，限制性片段長度多態(tài)性 （RFLP）的敏感性為20% 左右［4］。由 于JAK2V617F已作為骨髓增殖性疾病重要的分子診斷標志物，提高該突變檢測下限的敏感度將有助于臨床對該類疾病的早期診斷。

圖4 9例患者外周血基因組DNA中JAK2 V617F突變測序結果

COLD－PCR檢測微量突變的原理是基于相同的DNA序列中野生和突變的變性溫度不同所導致的擴增效率差異，對于G：C與T：A的突變導致Tc值僅存在1℃的差異［12］，本研究在 TaqMan－COLDPCR Tc值的選擇中也觀察到突變和野生間的擴增效率差異僅相差1℃（79.6℃－78.7℃），在既保證擴增效率又保證擴增效率差異的條件下，每0.1℃的變性溫度改變都對實驗有明顯影響，因此，選擇高精度溫控的PCR擴增儀非常重要，PCR分析儀升溫達到Tc值的溫度過沖和孔間溫差是影響本實驗精確度和重復性的關鍵因素。

由于JAK2V617F是獲得性造血干細胞突變，因此骨髓和外周血中JAK2V617F呈不同細胞系的突變。在外周血中，除粒系外，其它細胞系的基因組DNA 中皆不攜帶JAK2V617F突變［1，2，4］，因此，采用外周血基因組DNA檢測JAK2V617F突變率不能達到100%。本研究通過建立的TaqMan－COLD－PCR方法測定了9例患者外周血中JAK2V617F突變情況，其中6例陽性患者的JAK2V617F突變率為18.5%－50.9%，除外淋巴細胞基因組后，6例患者外周血中JAK2V617F突變率是26.2%－62.3%。

采用紫外分光光度計進行基因組DNA濃度校準，通過Real－time PCR定量檢測時，其拷貝數(shù)／ml并不相同，因此本研究首先對所有的基因組DNA中JAK2基因拷貝數(shù)／ml的濃度進行校準，然后再進行JAK2V617F突變率標準曲線的建立和患者標本檢測。通過對基因組DNA進行拷貝數(shù)／ml的濃度校準，使得本研究中JAK2V617F突變率的檢測更為準確。

綜上所述，本研究建立的TaqMan－COLD－PCR方法，以外周血基因組DNA作為檢測標本，可對JAK2V617F突變率進行定量檢測，突變率檢測下限為0.1%，該方法在一個反應體系內即可完成檢測，具有操作簡單、高通量檢測標本、重復性好、檢測報告時間短等特點。由于JAK2V617F突變已作為骨髓增殖性疾病的分子診斷標志物，該方法將明顯提高骨髓增殖性疾病的診斷靈敏度，并有助于上述疾病治療過程中治療效果的監(jiān)測。

［1］James C，Ugo V，Le Couedic JP，et al.A unique clonal JAK2mutation leading to constitutive signalling causes polycythaemia vera［J］.Nature，2005，434（7037）：1144.

［2］Kralovics R，Passamonti F，Buser AS，et al.A gain－of－function mutation of JAK2in myeloproliferative disorders［J］.N Engl J Med，2005，352（17）：1779.

［3］Levine RL，Wadleigh M，Cools J，et al.Activating mutation in the tyrosine kinase JAK2in polycythemia vera，essential thrombocythemia，and myeloid metaplasia with myelofibrosis［J］.Cancer Cell，2005，7（4）：387.

［4］Baxter EJ，Scott LM，Campbell PJ，et al.Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2in human myeloproliferative disorders［J］.Lancet，2005，365（9464）：1054.

［5］Zhao R，Xing S，Li Z，et al.Identification of an acquired JAK2mutation in polycythemia vera［J］.J Biol Chem，2005，280（24）：22788.

［6］Tefferi A，Vardiman JW.Classification and diagnosis of myeloproliferative neoplasms：the 2008World Health Organization criteria and point－of－care diagnostic algorithms［J］.Leukemia，2008，22：14.

［7］Xu X，Zhang Q，Luo J，et al.JAK2（V617F）：Prevalence in a large Chinese hospital population［J］.Blood，2007，109（1）：339.

［8］Li J，Wang L，Mamon H，et al.Replacing PCR with COLD－PCR enriches variant DNA sequences and redefines the sensitivity of genetic testing［J］.Nat Med，2008，14（5）：579.

［9］Jones AV，Kreil S，Zoi K，et al.Widespread occurrence of the JAK2V617Fmutation in chronic myeloproliferative disorders［J］.Blood，2005，106（6）：2162.

［10］James C，Delhommeau F，Marzac C，et al.Detection of JAK2 V617Fas a first intention diagnostic test for erythrocytosis［J］.Leukemia，2006，20（2）：350.

［11］McClure R，Mai M，Lasho T.Validation of two clinically useful assays for evaluation of JAK2V617Fmutation in chronic myeloproliferative disorders［J］.Leukemia，2006，20（1）：168.

［12］Liew M，Pryor R，Palais R，et al.Genotyping of single－nucleotide polymorphisms by high－resolution melting of small amplicons［J］.Clin Chem，2004，50（7）：1156.