漢防己甲素對(duì)肝癌耐藥細(xì)胞抑制作用機(jī)制研究

孫倩茹，王炳芳，張明，王慶華

(1.江蘇大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013;2.江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院消化科，江蘇昆山215300)

肝癌是惡性腫瘤中發(fā)病率和惡性程度較高的一種，因其早期診斷比較困難，晚期的手術(shù)存活率低且復(fù)發(fā)率高，嚴(yán)重危害人類的健康。采用化療多因肝癌的天然性和(或)獲得性耐藥，致使抗癌藥的細(xì)胞毒性降低，即使增加劑量，又因其嚴(yán)重的不良反應(yīng)而被迫中斷治療。

近來(lái)有漢防己甲素(tetrandrine，TET)抑制癌細(xì)胞增殖的報(bào)道［1－3］，但在其作用機(jī)制方面的研究中只提出了與P-170糖蛋白競(jìng)爭(zhēng)性抑制有關(guān)。本文通過(guò)研究TET對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度影響及其與腫瘤細(xì)胞的DNA合成、腫瘤細(xì)胞內(nèi)抗癌藥濃度等之間的關(guān)系，探討TET及其聯(lián)合抗癌藥抑制肝癌耐藥細(xì)胞系增殖的機(jī)制，以尋找藥物抗癌的新途徑，為新型抗癌藥物的研制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

肝癌耐藥細(xì)胞系(BEL-7402/DOX)由本研究室誘導(dǎo)［4］;TET(浙江金華制藥廠);多柔比星(doxorubicin，DOX)，F(xiàn)ura-2/AM，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自Sigma公司;Triton X-100由美國(guó)進(jìn)口，上?；瘜W(xué)試劑公司分裝廠分裝。

1.2 方法

1.2.1 TET及其聯(lián)合DOX對(duì)BEL-7402/DOX抑制率的測(cè)定 選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BEL-7402/DOX細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，以含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104/ml，分別加入48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔1.0 ml細(xì)胞懸液。置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，將其分為5組:單獨(dú)DOX組(1.0 mg/L)，單獨(dú) TET 組(2.5 mg/L)，兩種濃度的 TET(2.5 mg/L、5.0 mg/L)加 DOX 組(1.0 mg/L)，對(duì)照組加入等量的藥物溶劑。每個(gè)濃度做3個(gè)復(fù)孔，并分別加入MTT溶液20 μl(5.0 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀D(490 nm)處測(cè)量各孔的D值。抑制率=(對(duì)照組D值-藥物組D值)/對(duì)照組D值×100%。

1.2.2 癌細(xì)胞內(nèi)抗癌藥物DOX濃度的測(cè)定 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的BEL-7402/DOX細(xì)胞，以5×105/ml密度，每管加入2 ml(培養(yǎng)液稀釋)，同時(shí)加入5 mg/L的DOX，在此基礎(chǔ)上加入各種不同濃度的TET，每組3個(gè)復(fù)管，放入37℃的CO2孵育箱中培養(yǎng)1 h，用冷PBS 2 ml終止細(xì)胞代謝，1 000 r/min離心5 min，棄上清，細(xì)胞重復(fù)用冷PBS洗2遍，然后用PBS重新懸浮。將細(xì)胞在超聲波破碎儀上破碎1 min。破碎后正丁醇萃取，然后加 1.0 ml 0.9%NaCl，0.5 ml 30%三氯乙酸，振蕩混勻，4 000 r/min離心30 min，上清液在熒光分光光度計(jì)(475 nm/590 nm、狹縫各15 nm)上測(cè)定D值。

細(xì)胞內(nèi)藥物濃度的計(jì)算:在測(cè)定D值時(shí)，設(shè)一標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照管(本實(shí)驗(yàn)對(duì)照管為2 ml雙蒸水中加5 μg DOX)。

1.2.3 細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的測(cè)定 選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BEL-7402/DOX細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰酶消化后收集細(xì)胞懸液，10 000 r/min離心5 min。沉淀的細(xì)胞用PBS液懸浮，并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×1010/L。用臺(tái)盼藍(lán)染色判斷細(xì)胞活性(＞95%)。加入Fura-2/AM(終濃度為 10 μmol/L)，37℃ 避光孵育 50 min。10 000 r/min離心5 min。棄去上清液，用PBS液洗滌2次以除去殘留在細(xì)胞外的Fura-2/AM。最后加入等量的PBS液懸浮細(xì)胞，在RF-540島津熒光分光光度計(jì)上測(cè)定。為觀察Fura-2負(fù)載情況，將發(fā)射波長(zhǎng)(Em)固定在510 nm，Em光柵10 nm，掃描激發(fā)波長(zhǎng)(Ex)波峰，掃描范圍300～420 nm，掃描速度32 mm/min。熒光測(cè)定條件:Ex 340 nm，Em 510 nm，Em光柵10 nm，Ex光柵10 nm。根據(jù)公式［Ca2+］=Kd·(F－Fmin)/(Fmax－F)計(jì)算。Kd:Fura-2與Ca2+的解離常數(shù)，等于224 nmol/L;F:實(shí)際測(cè)得的熒光強(qiáng)度;Fmax:最大熒光值;Fmin:最小熒光值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 TET及其聯(lián)合DOX對(duì)BEL-7402/DOX的抑制作用

結(jié)果顯示，單用DOX和TET對(duì)肝癌耐藥細(xì)胞BEL-7402/DOX的抑制作用較弱;DOX與對(duì)細(xì)胞增殖基本無(wú)影響的2.5 mg/L濃度的TET合用時(shí)，其抑制率較單獨(dú)用DOX時(shí)明顯升高(P＜0.05);而與5.0 mg/L的TET合用時(shí)，其抑制率較單獨(dú)用DOX時(shí)升高更為顯著(P＜0.01)。結(jié)果表明，TET能協(xié)同化療藥物DOX的細(xì)胞毒性，且呈劑量依賴性，見表1。

表1 單獨(dú)用TET、DOX以及DOX與TET合用時(shí)對(duì)BEL-7402/DOX的抑制作用Tab 1 The inhibitory effect of BEL-7402/DOX cells treated with TET，DOX and TET plus DOX

2.2 TET對(duì)癌細(xì)胞內(nèi)抗癌藥物DOX濃度的影響

濃度分別為 2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mg/L 的TET分別與DOX共同加入BEL-7402/DOX及BEL/7402細(xì)胞中進(jìn)行孵育。結(jié)果顯示，濃度為2.5 mg/L的TET可明顯增加肝癌耐藥細(xì)胞內(nèi)DOX的濃度(P ＜0.05)，而當(dāng) TET 濃度為 5.0、10.0、20.0、40.0 mg/L時(shí)，其增加肝癌耐藥細(xì)胞內(nèi)DOX濃度的作用更為顯著，P均＜0.01。說(shuō)明TET可抑制抗癌藥物的外排。

2.3 TET對(duì)BEL-7402/DOX細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響

在細(xì)胞外液不含Ca2+(Hanks液除去CaCl2并加入0.1 mmol/L的EGTA)時(shí)的胞內(nèi)Ca2+濃度為(76±4)nmol/L，而當(dāng)細(xì)胞外液為含Ca2+的Hanks液時(shí)，測(cè)得其濃度為(261±46)nmol/L。在含有Ca2+的Hanks液的細(xì)胞中，加入不同濃度的TET處理，結(jié)果顯示，TET濃度為2.5 mg/L時(shí)，其濃度無(wú)明顯變化(P ＞0.05)，TET濃度為5.0 mg/L時(shí)可顯著降低癌細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度(P＜0.05)，而當(dāng)TET濃度為10.0 mg/L時(shí)，其降低癌細(xì)胞內(nèi)Ca2+的作用更為顯著(P＜0.01)，呈劑量依賴性。

3 討論

腫瘤多藥耐藥(MDR)是腫瘤化療失敗的主要原因之一，尋找低毒高效的腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)劑已成為腫瘤化療藥物領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，目前進(jìn)入臨床研究及應(yīng)用的化學(xué)藥物逆轉(zhuǎn)劑因作用機(jī)制單一、選擇性差、中毒劑量與有效劑量接近等諸多原因，其廣泛臨床應(yīng)用受到限制［5］。中藥因其資源分布廣泛、價(jià)格相對(duì)低廉、毒副反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)，一些學(xué)者已經(jīng)把逆轉(zhuǎn)肝癌多藥耐藥轉(zhuǎn)向了中藥的研究，中藥在腫瘤治療中具有廣闊的應(yīng)用前景［6－8］。

漢防己甲素(TET)又名粉防己堿，是存在于防己科植物粉防己根中的雙芐基異喹啉衍生物，與尼卡地平相似，是一種非選擇性的鈣通道拮抗劑。研究發(fā)現(xiàn)，尼卡地平等鈣通道拮抗劑能導(dǎo)致耐藥細(xì)胞內(nèi)化療藥物的積聚，其機(jī)制是逆轉(zhuǎn)劑能與細(xì)胞表面P-gp結(jié)合，導(dǎo)致其功能失活［9］。本研究結(jié)果顯示，TET對(duì)BEL-7402/DOX細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度有明顯的影響，能顯著降低細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度，且呈劑量依賴性，說(shuō)明用TET可替代尼卡地平，通過(guò)鈣通道拮抗作用而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。胞內(nèi)Ca2+作為細(xì)胞傳遞中的重要信使物質(zhì)，在某些細(xì)胞的增殖中發(fā)揮著重要作用。TET作為胞內(nèi)鈣拮抗劑可通過(guò)抑制胞內(nèi)存貯Ca2+釋放，阻抑與鈣有關(guān)的受體活性，使胞內(nèi)的Ca2+濃度降低。由于降低了胞內(nèi)Ca2+濃度，因而削弱了肌醇酯激酶的活性，故可抑制細(xì)胞特別是腫瘤細(xì)胞的增殖。

20世紀(jì)70、80年代，已有國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道顯示TET在體外對(duì)大鼠腹水型肝癌細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞、Hela細(xì)胞等多種細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制作用。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TET對(duì)細(xì)胞的增殖具有抑制作用。實(shí)驗(yàn)應(yīng)用2.5 mg/L的TET與DOX合用，結(jié)果顯示其抑制率較單獨(dú)用DOX明顯提高，增加TET的劑量(5.0 mg/L)，對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率提高更加明顯，進(jìn)一步說(shuō)明TET對(duì)耐藥肝癌細(xì)胞有直接的細(xì)胞毒作用，并能顯著增強(qiáng)抗癌藥物的細(xì)胞毒作用，在一定程度上逆轉(zhuǎn)耐藥肝癌細(xì)胞的耐藥性。

1976年Juliano等［10］首先觀察到具有MDR表型的CHO細(xì)胞藥物積聚發(fā)生障礙，相對(duì)分子質(zhì)量為170 000的膜糖蛋白—P-170糖蛋白過(guò)度表達(dá)。MDR細(xì)胞抗藥程度及胞內(nèi)藥物積聚與P-170糖蛋白過(guò)度表達(dá)有關(guān)。目前已有相關(guān)研究顯示TET逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞MDR的機(jī)制可能包括逆轉(zhuǎn)P-170糖蛋白的過(guò)度表達(dá)、逆轉(zhuǎn)谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶的催化解毒功能、抑制多藥耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)等方面［11］。

根據(jù)既往的文獻(xiàn)報(bào)道及我們的研究結(jié)果，TET的抗腫瘤細(xì)胞MDR作用方面已取得一定的研究成果，對(duì)未來(lái)臨床有一定的應(yīng)用前景，但是目前許多研究仍然局限于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)階段，大樣本的系統(tǒng)臨床研究報(bào)道還十分缺乏，其具體藥理、藥代動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)、更為詳盡的逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR的機(jī)制還需要更深層次的探索與研究。

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