不同發(fā)育階段恒牙牙髓組織中VEGF及受體的表達(dá)

關(guān)為群，王清妹

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院口腔科，福建福州350001)

在牙髓再生組織工程中，誘導(dǎo)血管再生是牙髓再生的關(guān)鍵。目前，誘導(dǎo)血管生成作用的因子有血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，堿性成纖維細(xì)胞生長因子，血小板源性生長因子，轉(zhuǎn)化生長因子α、β，腫瘤壞死因子，其中VEGF是血管生成最強(qiáng)有效的誘導(dǎo)者［1］。VEGF是一種高度特異的血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂素，它與體內(nèi)血管的形成及其滲透性的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，VEGF生物學(xué)功能的發(fā)揮歸功于其對(duì)VEGF受體的識(shí)別，其中VEGFR-1/Flt-1介導(dǎo)血管內(nèi)皮基底細(xì)胞滲透性的調(diào)節(jié)，VEGFR-2/Flk-1介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖分化及滲透性的調(diào)節(jié)，VEGFR-3介導(dǎo)淋巴管的形成［2-3］。人牙髓組織中也存在少量 VEGF［4］，但在人恒牙不同發(fā)育階段牙髓組織VEGF的表達(dá)是否存在差異，且牙齒發(fā)育不同階段VEGF發(fā)揮效用是否也是通過識(shí)別不同的受體Flt-1或Flk-1而實(shí)現(xiàn)，這是牙髓生理學(xué)中值得關(guān)注的問題。本實(shí)驗(yàn)的目的是通過組織和分子水平了解VEGF、Flt-1、Flk-1在人年輕恒牙和成熟恒牙牙髓組織的表達(dá)，為下一步應(yīng)用組織工程將VEGF及其受體作為干預(yù)因子導(dǎo)入不同發(fā)育階段牙髓組織內(nèi)，治療牙髓疾病提供新的思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

研究對(duì)象為福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院口腔科門診就診患者，取因正畸治療需要而拔除的健康前磨牙，參照文獻(xiàn)［5］恒牙牙根發(fā)育的階段劃分法，結(jié)合X線片及患者年齡，將受試牙分為根尖孔開放的年輕恒牙和根尖孔閉合的成熟恒牙各15例，所有牙體均無齲病，無畸形中央尖，牙周組織健康，患者無系統(tǒng)性疾病，研究獲得患者本人或家屬的知情同意。年輕恒牙組年齡為10～14歲，成熟恒牙組年齡20～25歲，男女均有。

1.2 免疫組化染色

1.2.1 標(biāo)本制備 按牙體脫鈣法進(jìn)行標(biāo)本制備［6］，經(jīng)常規(guī)標(biāo)本脫水石蠟包埋(圖1)，每個(gè)標(biāo)本于牙髓長軸最大體積處連續(xù)切片，厚約5 μm，取5張分別用于 HE染色，VEGF、Flt-1、Flk-1免疫組化染色及陰性對(duì)照。

圖1 不同發(fā)育階段恒牙牙根Fig 1 The root of different developmental phase of permanent teeth

1.2.2 免疫組化染色 采用常規(guī)SP法，DAB顯色，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，口腔牙周組織陽性染色片作為陽性對(duì)照。兔抗人Flt-1，F(xiàn)lk-1多克隆抗體(福州邁新生物技術(shù)公司)和兔抗人VEGF單克隆抗體(北京中杉試劑公司)的工作濃度均為1∶100。

1.2.3 圖像分析 鏡下(×400)每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，利用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對(duì)陽性染色部位的平均光密度(D)值進(jìn)行定量分析，以同張切片的空白區(qū)進(jìn)行校正。5個(gè)視野的均值為該樣本的最終D值。染色強(qiáng)度與D值大小成正比。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶反應(yīng)(RT-PCR)

1.3.1 RT-PCR 標(biāo)本制備 參照 Tjaderhane等［7］的方法，將新鮮的離體牙置于無菌Hanks液保存，距釉牙骨質(zhì)界根方3 mm將冠根分開，置于無菌Hanks液中，用鑷子和探針小心取出牙髓，用無菌小挖匙刮下髓腔壁的成牙本質(zhì)細(xì)胞，將取出的牙髓組織和成牙本質(zhì)細(xì)胞置于加入少量Trizol離心管中，以防止組織RNA降解，收集好的標(biāo)本-80℃冰箱中保存待檢。

1.3.2 RT-PCR反應(yīng) 提取牙髓組織總RNA，測(cè)定純度定量后按照Qiagen公司逆轉(zhuǎn)錄試劑進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。PCR反應(yīng)引物由上?？党缮锕こ坦竞铣?。內(nèi)參照GAPDH(299 bp)F:5'-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3'，R:5'-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3';VEGF(145 bp)F:5'-AGGGAAGAGGAGGAGATGAG-3'，R:5'-GCTGGGTTTGTCGGTGTT-3';Flt-1(169 bp)F:5'-GCAACAAGCCCGTTAGCC-3'，R:5'-CCCACATGGTGCGTCTCA-3';Flk-1(162 bp)F:5'-CCAATAATCAGAGTGGCAGTG-3'，R:5'-CATAGACATAAATGACCGAGGC-3'。反應(yīng)體系:10 ×PCR緩沖液 2.5 μl，dNTP 2.5 μl，Taq 聚合酶 1 U，10 μmol/L 的 PCR 特異引物 F 1 μl，10 μmol/L 的 PCR特異引物 R 1 μl，cDNA1 μl，ddH2O 30 μl。反應(yīng)條件為 GAPDH:95℃，5 min;35個(gè)PCR循環(huán)(95℃，10 s;59℃，15 s;72℃，20 s;83℃收集熒光，5 s)，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后繼續(xù)從72℃緩慢加熱到99℃(每5 s升高1℃)建立 PCR產(chǎn)物的熔解曲線。VEGF:95℃，5 min;35 個(gè) PCR 循環(huán)(95℃，10 s;59℃，15 s;72℃，20 s;84℃收集熒光，5 s)，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后繼續(xù)從72℃緩慢加熱到99℃(每5 s升高1℃)建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線。Flt-1:95℃，5 min;35個(gè) PCR循環(huán)(95℃，10 s;59℃，15 s;72℃，20 s;83℃收集熒光，5 s)，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后繼續(xù)從72℃緩慢加熱到99℃(每5 s升高1℃)建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線。Flk-1:95℃，5 min;35 個(gè) PCR 循環(huán)(95℃，10 s;59℃，15 s;72℃，20 s;81.5℃收集熒光，5 s)，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后繼續(xù)從72℃緩慢加熱到99℃(每5 s升高1℃)建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線。在指數(shù)增長期，得到的產(chǎn)物才和循環(huán)數(shù)有線性的關(guān)系，可進(jìn)行半定量RTPCR分析。PCR產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，應(yīng)用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 牙髓組織VEGF、Flt-1、Flk-1免疫組化染色

VEGF表達(dá)于細(xì)胞的胞質(zhì)或胞膜上，在牙髓血管內(nèi)皮細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞中都有表達(dá)。其中血管內(nèi)皮細(xì)胞呈條索狀強(qiáng)陽性染色，其他細(xì)胞中呈絮狀、線狀或顆粒狀表達(dá)。Flt-1，F(xiàn)lk-1主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)中。牙髓中Flt-1，F(xiàn)lk-1的表達(dá)均弱于VEGF(圖2)。

圖2 不同發(fā)育階段恒牙牙髓VEGF及受體的組織學(xué)表達(dá)Fig 2 Histological expression of VEGF，F(xiàn)lt-1，F(xiàn)lk-1 in the pulp of young and mature permanent teeth

2.2 年輕恒牙和成熟恒牙牙髓VEGF，F(xiàn)lt-1，F(xiàn)lk-1的D值分析

兩獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn)，得出年輕恒牙組牙髓VEGF，F(xiàn)lk-1表達(dá)比成熟恒牙組的高(P ＜0.05)，而Flt-1的表達(dá)比成熟恒牙組中的低(P＜0.05)見表1。

表1 年輕恒牙和成熟恒牙牙髓VEGF，F(xiàn)lt-1，F(xiàn)lk-1陽性染色D值Tab 1 The positive dyeing D value of VEGF，F(xiàn)lt-1，F(xiàn)lk-1 in the pulp of young and mature permanent teeth n=15

2.3 VEGF 、Flt-1、Flk-1 mRNA 的表達(dá)

以年輕恒牙和成熟恒牙牙髓標(biāo)本總RNA進(jìn)行RT-PCR，瓊脂糖凝膠電泳顯示年輕恒牙和成熟恒牙牙髓標(biāo)本均在145 bp，162 bp，169 bp位置出現(xiàn)條帶，與預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小一致(圖3)。

VEGF、Flt-1、Flk-1基因相對(duì)含量見表2。結(jié)果提示:年輕恒牙VEGF及其受體Flt-1、Flk-1的表達(dá)分別是成熟恒牙的1.7倍、0.6倍和1.5倍。

表 2 VEGF、Flt-1、Flk-1 mRNA 相對(duì)含量Tab 2 The relative content of VEGF，F(xiàn)lt-1，F(xiàn)lk-1 mRNA

圖3 RT-PCR檢測(cè)VEGF，F(xiàn)lt-1，F(xiàn)lk-1在年輕恒牙和成熟恒牙中的分子水平表達(dá)情況Fig 3 Molecule level expression of VEGF，F(xiàn)lt-1，F(xiàn)lk-1 in the pulp of young and mature permanent teeth

3 討論

牙髓是一種疏松結(jié)締組織，位于由牙本質(zhì)所形成的髓腔內(nèi)，包含細(xì)胞、纖維、神經(jīng)、血管、淋巴管和其他細(xì)胞外基質(zhì)。牙髓的主要功能是形成牙本質(zhì)、營養(yǎng)、感覺、防御及修復(fù)。牙本質(zhì)修復(fù)過程中血管源性生長因子可誘導(dǎo)局部新生血管形成，是牙本質(zhì)成功修復(fù)的關(guān)鍵，其中VEGF是血管生成最強(qiáng)而有效的誘導(dǎo)劑，它通過與VEGF受體的識(shí)別后發(fā)揮作用。在VEGF受體中，F(xiàn)lt-1與VEGF的親和力比Flk-1高10倍［8］，但不能激活內(nèi)皮細(xì)胞增殖的信號(hào)，可能是作為VEGF促血管生成的反向調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用。VEGF刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、增加血管的通透性和新血管的生成作用主要是通過結(jié)合和激活Flk-1來實(shí)現(xiàn)的［9］。本實(shí)驗(yàn)免疫組化結(jié)果顯示年輕恒牙和成熟恒牙牙髓組織中均有VEGF、Flt-1、Flk-1免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞，且VEGF與Flk-1在年輕恒牙中的表達(dá)明顯高于成熟恒牙，說明在促進(jìn)年輕恒牙根尖發(fā)育過程中VEGF能通過與Flk-1結(jié)合而發(fā)揮誘導(dǎo)人牙髓細(xì)胞增殖分化成成牙本質(zhì)細(xì)胞和促進(jìn)修復(fù)性牙本質(zhì)的形成。而發(fā)育成熟的恒牙牙髓組織形成血管相關(guān)因子VEGF原有的基礎(chǔ)表達(dá)量不足，同時(shí)Flt-1表達(dá)相對(duì)年輕恒牙增強(qiáng)，競(jìng)爭(zhēng)性地阻抗VEGF與Flk-1的結(jié)合，雙重作用的結(jié)果導(dǎo)致其牙髓組織血管合成能力的下降，修復(fù)性牙本質(zhì)的修復(fù)能力相對(duì)年輕恒牙弱。

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)年輕恒牙VEGF及其受體Flt-1、Flk-1的表達(dá)分別是成熟恒牙的1.7倍及0.7倍、1.3倍，提示年輕恒牙牙髓 VEGF、Flt-1、Flk-1的表達(dá)與成熟恒牙存在差異，反映了年輕恒牙牙髓組織血管再生潛力高于成熟恒牙，臨床對(duì)年輕恒牙的牙髓修復(fù)干預(yù)可能可以通過調(diào)節(jié)VEGF和Flk-1的表達(dá)這一新的途徑得以實(shí)現(xiàn)。而對(duì)成熟恒牙的牙髓修復(fù)可能通過增強(qiáng)VEGF或降低Flt-1的表達(dá)來干預(yù)。已有研究表明VEGF/VEGFR家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑受多種因素影響，如一個(gè)特定的環(huán)境，內(nèi)皮基膜，周圍支持細(xì)胞的濃度都可以影響內(nèi)皮細(xì)胞的表型和功能乃至VEGF/VEGFR的生物學(xué)效應(yīng)，血流很可能是激活VEGF/VEGFR的另一個(gè)重要因素［10］。年輕恒牙中牙髓血供豐富，脈管管腔大而多，基質(zhì)細(xì)胞充滿整個(gè)組織間隙且根尖呈開放狀，有利于牙髓內(nèi)外血供交流，可能是其血管再生潛力高于成熟恒牙的重要因素。

最大限度地保存牙髓的活力或促進(jìn)牙髓的再生，是目前牙體牙髓病治療過程中追求的目標(biāo)。對(duì)不同年齡及不同牙髓狀態(tài)中VEGF及其相關(guān)受體表達(dá)的研究，提示將來臨床上利用牙髓組織工程治療不同牙髓狀態(tài)的牙髓疾病時(shí)，可以依治療需要，將外源性VEGF及相關(guān)受體加入到支架和牙髓細(xì)胞的復(fù)合體中，促進(jìn)血管再生、參與調(diào)節(jié)纖維原細(xì)胞的分化和神經(jīng)纖維的生長，最終誘導(dǎo)牙髓完全性修復(fù)牙本質(zhì)的形成［11］;或是利用基因技術(shù)，將人VEGF及受體基因轉(zhuǎn)入種子細(xì)胞(如牙髓干細(xì)胞或成纖維細(xì)胞)，使種子細(xì)胞持續(xù)產(chǎn)生VEGF和相關(guān)受體，為修復(fù)性牙本質(zhì)形成提供足夠的血管化并調(diào)節(jié)細(xì)胞的活性，從而達(dá)到治愈牙髓病的目的，這需進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床驗(yàn)證研究［12］。

［1］Ferrara N.VEGF and the quest for tumour angiogenesis factors［J］.Nat Rev Cancer，2002，2(10):795-803.

［2］Pimenta FJ，Sá AR，Gomez RS.Lymphangiogenesis in human dental pulp［J］.Int Endod J，2003，36(12):853-856.

［3］Ferrara N.Role of vascular endothelial growth factor in regulation of physiological angiogenesis［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2001，280(6):C1358-1366.

［4］Grando Mattuella L，Westphalen Bento L，de Figueiredo JA，et al.Vascular endothelial growth factor and its relationship with the dental pulp［J］.J Endod，2007，33(5):524-530.

［5］Haralabkis NB，Yiagtzis SC，Toutountzakis NM.Premature or delayed exfoliation of deciduous teeth and root resorption and formation［J］.Angle Orthod，1994，64(2):151-157.

［6］關(guān)為群，王清妹.牙體脫鈣法和劈牙取髓法觀察牙髓組織中VEGF表達(dá)的效果比較［J］.江蘇大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2010，20(5):409-411.

［7］Tjaderhane L，Salo T，Larjava H，et al.A novel organ culture method to study the function of human odontoblasts in vitro:gelatinase expression by odontoblasts is differentially regulated by TGF-betal［J］.J Dent Res，1998，77(7):1486-1496.

［8］Roberts DM，Kearney JB，Johnson JH，et al.The vascular endothelial growth factor(VEGF)receptor Flt-1(VEGFR-1)modulates Flk-1(VEGFR-2)signaling during blood vessel formation［J］.Am J Pathol，2004，164(5):1531-1535.

［9］Gille H，Kowalski J，Li B，et al.Analysis of biological effects and signaling properties of Flt-1(VEGFR-1)and KDR(VEGFR-2).A reassessment using novel receptorspecific vascular endothelial growth factor mutants［J］.J Biol Chem，2001，276(5):3222-3230.

［10］倪效，燕敏.VEGF受體功能研究進(jìn)展［J］.生命科學(xué)，2008，20(1):120-124.

［11］王雙義，蘇麗萍，曹建明，等.血管內(nèi)皮生長因子在口腔頜面骨組織工程中的應(yīng)用［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2007，11(14):2741-2744.

［12］Zhang W，Yelick PC.Vital pulp therapy-current progress of dental pulp regeneration and revascularization［J］.Int J Dent，2010，16(1):1-10.