雷公藤甲素通過調(diào)節(jié)microRNA21的表達(dá)干預(yù)K562/A02細(xì)胞的化療敏感性

惠璐璐，許文林，沈慧玲，陳巧云，朱小蘭，龍璐璐，徐穎

(江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇鎮(zhèn)江212002)

MicroRNAs是1993年Lee等［1］在線蟲發(fā)育的研究中首先發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，長約21～24個(gè)核苷酸。它通過干擾mRNA的翻譯而下調(diào)靶基因的表達(dá)，能夠?qū)虮磉_(dá)進(jìn)行微調(diào)，參與生命過程中一系列的重要進(jìn)程，包括早期發(fā)育、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等［2］。近年來，越來越多的研究表明，microRNAs能夠影響腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性［3］。有研究證明，抑制microRNA21表達(dá)能增強(qiáng)白血病細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性［4］。

前期研究發(fā)現(xiàn)［5］，雷公藤甲素(triptolide，TPL)是從中藥雷公藤中提取的環(huán)氧化二萜內(nèi)酯化合物，對(duì)K562/A02細(xì)胞中microRNA21表達(dá)有下調(diào)作用。本實(shí)驗(yàn)旨在探討TPL提高K562/A02化療敏感性相關(guān)機(jī)制，為臨床白血病多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)提供一條新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料

人慢性髓系白血病細(xì)胞株K562及其耐藥株K562/A02購于中科院上海細(xì)胞庫。K562細(xì)胞、K562/A02細(xì)胞置于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，2～3 d換液1次，K562/A02細(xì)胞培養(yǎng)液中含多柔比星(doxorubicin，DOX)終濃度為 1.0 μg/ml以維持其耐藥性，實(shí)驗(yàn)前脫藥培養(yǎng)2周，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。多柔比星為浙江海正制藥廠產(chǎn)品。噻唑藍(lán)(MTT)為Sigma公司。雷公藤甲素購自美國Sigma公司，RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國GibcoBRL公司。AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國Biovision公司。PI試劑盒購自Sigma公司，4℃保存。SYBR Green熒光定量PCR試劑盒購自大連寶生物公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測TPL的細(xì)胞毒性 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/ml，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加入細(xì)胞懸液200 μl，24 h后，設(shè)置調(diào)零孔，空白對(duì)照孔和加藥孔，每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)72 h，每孔加MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，終止反應(yīng)。在酶聯(lián)免疫測定儀上檢測波長570 nm處光密度(D)值，分析TPL非細(xì)胞毒濃度。

1.2.2 TPL對(duì)K562/A02細(xì)胞多柔比星敏感性的影響 采用“1.2.1”MTT方法，檢測不同濃度多柔比星聯(lián)合TPL或單獨(dú)作用下，K562/A02細(xì)胞的存活率。為避免TPL自身誘導(dǎo)凋亡對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，TPL采用非細(xì)胞毒濃度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 按 Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作。收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，以每孔5×105個(gè)接種于6孔板中，對(duì)照組給予3 μg/ml多柔比星，實(shí)驗(yàn)組給予3 μg/ml多柔比星聯(lián)合TPL，作用24 h，棄培養(yǎng)基，4℃預(yù)冷PBS洗滌2次，1 000 r/min離心，1×106/ml的密度重懸細(xì)胞于100 μl的1×結(jié)合緩沖液中，加入5 μl AnnexinV和10 μl PI染液，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min，再加入300 μl上述緩沖液，于1 h內(nèi)置流式細(xì)胞儀檢測。AnnexinV(+)/PI(－)為凋亡細(xì)胞，雙染色陽性為壞死細(xì)胞或凋亡晚期細(xì)胞。

1.2.4 熒光定量PCR檢測microRNA21表達(dá) 依據(jù)TRIzol試劑盒說明書，提取細(xì)胞內(nèi)總RNA。以U6為內(nèi)參，采用SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測細(xì)胞內(nèi)microRNA21的表達(dá)水平［7］。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 microRNA21模擬物及抑制劑轉(zhuǎn)染 microRNA21模擬物和抑制劑均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司化學(xué)合成。microRNA21抑制劑的序列為5'-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3';microRNA21模擬物序列為5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3'。收集對(duì)數(shù)生長期K562及K562/A02細(xì)胞，以每孔4 ×105個(gè)接種于 6 孔板中，置 37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h，依據(jù)試劑盒說明利用脂質(zhì)體2000分別將microRNA21模擬物、抑制劑轉(zhuǎn)染到K562和K562/A02細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染24 h后，TRIzol法提取總RNA，熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中microRNA21的表達(dá)，并進(jìn)行多柔比星藥物敏感度檢測;轉(zhuǎn)染72 h后，蛋白質(zhì)印跡法檢測Bcl-2蛋白表達(dá)。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測Bcl-2蛋白水平 收集細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，加入細(xì)胞裂解液，作用1 min，收集細(xì)胞裂解物10 000 r/min離心5 min，用Bio-Rad蛋白試劑盒測定濃度。等量蛋白(每孔25 μg)用12%SDS-PAGE電泳分離，100 V電轉(zhuǎn)2 h置硝酸纖維素膜，在含有0.1%Tween-20的5%脫脂奶粉中，室溫封閉1h。Bcl-2和GAPDH一抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min。二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，加入ECL發(fā)光試劑，攝影，對(duì)圖片進(jìn)行灰度掃描。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用方差分析和兩組資料比較的t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TPL的細(xì)胞毒性作用

不同濃度的雷公藤甲素分別作用于K562和K562/A02細(xì)胞株72 h，MTT檢測活細(xì)胞數(shù)。從圖1可以看到，在 TPL濃度為 5 nmol/L時(shí)，TPL對(duì)K562/A02細(xì)胞的存活率沒有明顯影響。因此，采用5 nmol/L作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的TPL濃度。

圖1 TPL對(duì)K562和K562/A02細(xì)胞的毒性Fig 1 Inhibition of triptolide to K562 and K562/A02 cell lines

2.2 TPL對(duì)K562/A02細(xì)胞多柔比星敏感性的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，相對(duì)于多柔比星單獨(dú)處理組，5 nmol/L TPL聯(lián)合不同濃度多柔比星作用于細(xì)胞72 h后，能夠明顯增強(qiáng)K562/A02細(xì)胞對(duì)多柔比星的敏感性(圖2A)。AnnexinV/PI雙染色定量檢測結(jié)果顯示5 nmol/L TPL聯(lián)合多柔比星作用與3 μg/ml多柔比星單獨(dú)作用相比，K562/A02細(xì)胞平均凋亡率由 4.3% 明顯上升到 18.5%(t=4.3，P ＜0.05)，見圖2B ～D。

圖2 TPL對(duì)K562/A02細(xì)胞多柔比星敏感性的影響Fig 2 Reversal of doxorubicin resistance in vitro by triptolide

2.3 TPL對(duì) K562/A02細(xì)胞 microRNA21和 Bcl-2表達(dá)的影響

熒光定量 PCR檢測microRNA21表達(dá)水平，U6RNA作為內(nèi)參;蛋白質(zhì)印跡法檢測Bcl-2蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，5 nmol/L TPL作用后，K562/A02細(xì)胞中microRNA21、Bcl-2蛋白表達(dá)水平較未處理組明顯降低(t=5.12，P ＜0.05)，見圖 3。

圖3 TPL對(duì)K562/A02細(xì)胞株microRNA21及Bcl-2表達(dá)的影響Fig 3 Down-regulation of microRNA21 and Bcl-2 expression by triptolide

2.4 microRNA21對(duì)K562/A02細(xì)胞多柔比星敏感性的影響

為進(jìn)一步證明microRNA21在白血病耐藥形成中的作用，分別將microRNA21模擬物和 microRNA21抑制劑轉(zhuǎn)染到K562和K562/A02細(xì)胞中，圖4A、4B顯示，轉(zhuǎn)染microRNA21模擬物能升高K562細(xì)胞microRNA21表達(dá);而轉(zhuǎn)染了microRNA21抑制劑后，K562/A02細(xì)胞microRNA21表達(dá)明顯下降;轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照(NC)無明顯變化。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)提示，轉(zhuǎn)染microRNA21模擬物后，K562細(xì)胞對(duì)多柔比星敏感性減低，細(xì)胞凋亡減少;而轉(zhuǎn)染了microRNA21抑制劑后，K562/A02細(xì)胞對(duì)多柔比星敏感性明顯增高，細(xì)胞凋亡增多(圖4C、4D)。

圖4 microRNA21對(duì)K562/A02細(xì)胞多柔比星敏感性的影響Fig 4 Effect of microRNA21 on doxorubicin sensitivity

2.5 microRNA21對(duì) K562/A02細(xì)胞中 Bcl-2表達(dá)的影響

蛋白質(zhì)印跡檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照(NC)對(duì)Bcl-2表達(dá)無明顯變化;而轉(zhuǎn)染microRNA21抑制劑組，Bcl-2表達(dá)顯著降低，轉(zhuǎn)染了microRNA21模擬物的K562細(xì)胞中Bcl-2蛋白水平明顯增高(圖5)。

圖5 microRNA21對(duì)K562/A02細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)的影響Fig 5 Effect of microRNA21 on Bcl-2 expression

3 討論

化療是白血病治療所不可缺少的一項(xiàng)措施。然而，隨著多藥耐藥的日趨產(chǎn)生，白血病復(fù)發(fā)率明顯增高。白血病多藥耐藥產(chǎn)生機(jī)制十分復(fù)雜，其中抗凋亡機(jī)制尤為重要［6］。幾乎所有的化療藥物都是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來發(fā)揮抗腫瘤作用［8］。多藥耐藥的產(chǎn)生可能是白血病細(xì)胞通過表達(dá)一種抗凋亡蛋白(如 Bcl-2)誘導(dǎo)凋亡的作用［9］。

Bcl-2是細(xì)胞凋亡機(jī)制中的一種關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，是抑制凋亡的關(guān)鍵分子，在許多腫瘤中過表達(dá)，造成腫瘤的多藥耐藥。Bcl-2除了受轉(zhuǎn)錄因子和蛋白酶的調(diào)節(jié)作用外，近來，有人發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中，Bcl-2的表達(dá)水平還受microRNA的影響，其中microRNA21 備受關(guān)注［10］。

MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA。成熟的miRNAs是由較長的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過一系列核酸酶的剪切加工而產(chǎn)生的［4］。據(jù)推測，人類基因組可能存有1 000多種miRNA基因，目前已知700多種，約1/3的蛋白編碼基因受miRNA調(diào)控。近來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與眾多腫瘤的多藥耐藥密切相關(guān)。microRNA21是一種致癌基因，在多種腫瘤中過表達(dá)，如肺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等［11］。microRNA21能下調(diào)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Ⅰ(RBI)，轉(zhuǎn)移生長因子β受體Ⅱ(TGFBR2)、程序性死亡基因4(PDCD4)等抑癌基因的表達(dá)，從而促進(jìn)癌細(xì)胞增殖［12］。Bai等［13］的研究發(fā)現(xiàn)microRNA21在白血病耐藥中起關(guān)鍵作用。Meng等［14］證實(shí)，膽管癌患者存在 microRNA21過表達(dá)現(xiàn)象，并且這種過表達(dá)導(dǎo)致患者對(duì)吉西他濱不敏感。Si等［15］發(fā)現(xiàn)，用反義核酸技術(shù)下調(diào)microRNA21可以增強(qiáng) MCF-7細(xì)胞對(duì)拓?fù)涮婵档拿舾行?，這可能是由于抑制microRNA21造成Bcl-2蛋白的低表達(dá)，從而促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。Dong等［16］發(fā)現(xiàn)microRNA21直接作用于Bcl-2，并上調(diào)其表達(dá)。然而，關(guān)于microRNA21與白血病多藥耐藥的報(bào)道較少。本研究發(fā)現(xiàn)，多柔比星耐藥的K562/A02細(xì)胞中microRNA21高表達(dá)，提示miRNA與白血病多藥耐藥有關(guān)，microRNA21可作為逆轉(zhuǎn)或預(yù)防白血病多藥耐藥的治療靶點(diǎn)。

雷公藤甲素又名雷公藤內(nèi)酯醇，是臨床上應(yīng)用的各種雷公藤制劑的主要活性成分。近來，大量研究發(fā)現(xiàn)TPL是一種廣譜的腫瘤抑制劑［17］。最近，陸續(xù)有研究報(bào)道TPL可以增強(qiáng)化療藥物的細(xì)胞毒作用。Chen等［18］發(fā)現(xiàn)，雷公藤甲素能夠提高5-氟尿嘧啶對(duì)KB細(xì)胞的抗腫瘤活性。

本實(shí)驗(yàn)首先檢測了TPL對(duì)K562/A02及K562細(xì)胞的毒性。采用非細(xì)胞毒性濃度的TPL(5 nmol/L)作用于K562/A02細(xì)胞72 h后，可以顯著增強(qiáng)其對(duì)多柔比星的化療敏感性，K562/A02細(xì)胞中microRNA21表達(dá)水平明顯下降。進(jìn)一步研究顯示，伴隨著microRNA21水平的下降，Bcl-2蛋白表達(dá)水平也降低。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)TPL可以提高慢性髓系白血病耐藥細(xì)胞K562/A02對(duì)多柔比星化療敏感性，其機(jī)制可能是通過下調(diào)microRNA21及其靶基因Bcl-2來促進(jìn)多柔比星誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡所實(shí)現(xiàn)的，這為臨床白血病多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)治療提供了新的思路。

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