TGF-β1誘導(dǎo)人肝HL7702細(xì)胞發(fā)生上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)研究

李婷芬，王冰瑩，嚴(yán)永敏，李里明，蔣留留，錢(qián)暉

(江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013)

肝纖維化是一種肝臟正常結(jié)構(gòu)破壞，膠原沉積的過(guò)程［1］，目前肝纖維化的發(fā)病機(jī)制尚有爭(zhēng)議。TGF-β1 是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchyme transition，EMT)最重要的調(diào)節(jié)分子，Zeisberg 等［2］發(fā)現(xiàn)小鼠肝纖維化中成纖維細(xì)胞來(lái)源于局部肝細(xì)胞經(jīng)TGF-β1作用發(fā)生EMT，骨形成蛋白7(BMP7)抑制EMT后，相應(yīng)肝纖維化也得到修復(fù)。Kaimori等［3］把小鼠原代肝細(xì)胞和小鼠肝細(xì)胞系A(chǔ)ML12做了對(duì)比，發(fā)現(xiàn) TGF-β1會(huì)誘導(dǎo)成熟的小鼠肝細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)變。Chen等［4］也發(fā)現(xiàn)體外 TGF-β1誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)變。但是人肝臟纖維化與EMT關(guān)系的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)旨在探討人肝細(xì)胞系HL7702在TGF-β1誘導(dǎo)下是否發(fā)生EMT，并檢測(cè)EMT相關(guān)基因蛋白的表達(dá)變化，為進(jìn)一步研究EMT和肝纖維化之間的具體機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 人肝細(xì)胞HL7702購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 主要試劑 1640培養(yǎng)基，小牛血清(Gibco公司);人類(lèi)重組TGF-β1(Peprotech公司);兔抗人多克隆E-鈣黏附蛋白抗體(SAB公司);鼠抗人多克隆N-鈣黏附蛋白抗體(BD公司);鼠抗人多克隆波形蛋白抗體(Santa cruz公司);鼠抗多克隆GAPDH抗體，羊抗鼠IgG，羊抗兔IgG(上?？党晒?;Trizol試劑(Invitrogen公司)，RT-PCR試劑盒(MBI公司)，SYBR Green熒光染料(ToYoBo公司)。

1.1.3 主要儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱(Forma，Scientific公司)，倒置式生物顯微鏡(Ti，Nikon公司)，PCR儀(2720，ABI公司)，熒光定量 PCR分析儀(CFX96TM，Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 TGF-β1 刺激人肝細(xì)胞 HL7702 HL7702 于20%小牛血清(1640)培養(yǎng)基37℃ 5%CO2孵箱中培養(yǎng)，每3天換1次營(yíng)養(yǎng)液。消化傳代后HL7702分別種于6孔板，細(xì)胞濃度為1×107/孔。20%小牛血清(1640)營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)2 d后，撤除營(yíng)養(yǎng)液換成無(wú)血清1640 培養(yǎng)基和 TGF-β1 2 ng/ml培養(yǎng) 24，48，72 h后，通過(guò)倒置顯微鏡觀察誘導(dǎo)前后細(xì)胞的形態(tài)變化。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)EMT相關(guān)基因 用Trizol試劑提取誘導(dǎo)前后細(xì)胞總RNA，以總RNA為模板，Oligo dT為引物，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，qRT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)量，各引物序列見(jiàn)表 1。qRT-PCR反應(yīng)體系:10 μl 2 ×SYBR Green 熒光染料，引物1 和引物2 各0.5 μl，Taq DNA聚合酶 0.1 μl，1 μl cDNA，補(bǔ)水至總體積 20 μl。循環(huán)35 次:94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃30 s，E-鈣黏附蛋白(80℃)，N-鈣黏附蛋白，Twist(75℃)，β-肌動(dòng)蛋白(78℃)采集熒光;隨后72℃延伸5 min，最后進(jìn)行72℃ ～99℃的熔解曲線分析。E-鈣黏附蛋白、N-鈣黏附蛋白、Twist的數(shù)據(jù)與β-肌動(dòng)蛋白數(shù)據(jù)采用相對(duì)比值法處理。

表1 引物堿基序列Tab 1 Primer sequence

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白 誘導(dǎo)組及未誘導(dǎo)組細(xì)胞經(jīng)裂解液充分裂解后，加入等體積5×SDS上樣緩沖液于蛋白裂解上清液中，煮沸5 min。進(jìn)行聚丙烯酰胺電泳，每孔上樣等量總蛋白。分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5% 脫脂牛奶室溫封閉1 h后，加入E-鈣黏附蛋白(1∶200)、N-鈣黏附蛋白(1∶2 000)、波形蛋白(1 ∶500)及GAPDH(1∶10 000)抗體稀釋液，4℃過(guò)夜。TBS/0.5%Tween20洗膜3次后，再加入1∶5 000抗HRP抗體稀釋液37℃ 孵育1 h，TBS、0.5%Tween20充分洗膜3次后，用預(yù)混HRP化學(xué)發(fā)光底物(Luminata crescendo western HRP substrate)檢測(cè)蛋白。

1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用GraphpadPrism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HL7702細(xì)胞誘導(dǎo)前后的形態(tài)學(xué)變化

體外培養(yǎng)的HL7702細(xì)胞的形態(tài)是不規(guī)則的六邊形，經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)24 h后細(xì)胞形態(tài)基本沒(méi)有變化，48 h后少量的細(xì)胞拉長(zhǎng)變成紡錘形，72 h后細(xì)胞形態(tài)的變化很明顯，大量的細(xì)胞完全變成紡錘形，細(xì)胞之間的間隙也變大(圖1)。

2.2 TGF-β1誘導(dǎo)后HL7702細(xì)胞EMT相關(guān)基因表達(dá)

通過(guò)觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化，選擇72 h的細(xì)胞提取總RNA用于定量分析，結(jié)果顯示HL7702細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)72 h后E-鈣黏附蛋白mRNA的表達(dá)較對(duì)照組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.353，P＜0.05)。而 N-鈣黏附蛋白，Twist mRNA 的表達(dá)較對(duì)照組 HL7702顯著增加(t=3.850，P＜0.05;t=5.433，P ＜0.05)。見(jiàn)圖2。

圖1 TGF-β1誘導(dǎo)前后HL7702細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化(×100)Fig 1 Morphology changes after TGF-β1 induction in HL7702 cells

圖2 TGF-β1誘導(dǎo)后HL7702細(xì)胞EMT相關(guān)基因mRNA的表達(dá)Fig2 Relative EMT-associated gene expression level after TGF-β1 treatment in HL7702 cells

2.3 TGF-β1誘導(dǎo)后HL7702細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，HL7702誘導(dǎo)24 h和48 h后E-鈣黏附蛋白基本沒(méi)什么變化，72 h后E-鈣黏附蛋白表達(dá)明顯減弱(P＜0.001)。而N-鈣黏附蛋白、波形蛋白均隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)明顯增強(qiáng)。見(jiàn)圖3。

3 討論

TGF-β1是一組具有多種功能的蛋白多肽，對(duì)細(xì)胞的增殖分化、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)形成、組織損傷修復(fù)起著重要作用［5］。TGF-β1是肝臟中最主要的成分，隨著對(duì)TGF-β1認(rèn)識(shí)逐步加深，人們發(fā)現(xiàn)肝纖維化與TGF-β1有重要的聯(lián)系。本研究采用TGF-β1作用于人肝細(xì)胞系HL7702之后，通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，EMT相關(guān)基因和蛋白表達(dá)分析，證明了肝細(xì)胞HL7702經(jīng)過(guò)TGF-β1誘導(dǎo)后確實(shí)發(fā)生了EMT，上皮化標(biāo)記E-鈣黏附蛋白顯著下降，間質(zhì)化標(biāo)記N-鈣黏附蛋白、波形蛋白和 Twist顯著增加。肝細(xì)胞漸漸失去了上皮細(xì)胞的特性和功能。

E-鈣黏附蛋白、N-鈣黏附蛋白、波形蛋白和 Twist是EMT的重要檢測(cè)指標(biāo)，TGF-β1廣泛用于EMT的誘導(dǎo)［2-4］。相關(guān)研究已表明TGF-β1誘導(dǎo)小鼠的原代肝細(xì)胞和肝細(xì)胞系發(fā)生EMT之后，上皮化標(biāo)記E-鈣黏附蛋白下降，間質(zhì)化標(biāo)記N-鈣黏附蛋白和波形蛋白顯著增加［3-4］，這說(shuō)明細(xì)胞失去了上皮化特性和功能，具有間質(zhì)化細(xì)胞的特性和分泌膠原的功能。在小鼠體內(nèi)纖維化的實(shí)驗(yàn)中，小鼠肝內(nèi)大量的成纖維細(xì)胞也是由肝細(xì)胞經(jīng)過(guò)EMT而來(lái)，促使肝纖維化中膠原的形成［2］。研究發(fā)現(xiàn) TGF-β1誘導(dǎo)上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的機(jī)制與Snail-1轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)。Snail-1轉(zhuǎn)錄因子是EMT發(fā)生的關(guān)鍵分子［6-8］，TGF-β1激活 Snail-1與E-鈣黏附蛋白轉(zhuǎn)錄的抑制有關(guān)系，Snail-1是間質(zhì)化標(biāo)記波形蛋白的上游分子［9］。Kaimori等［3］發(fā)現(xiàn)用Smad4-siRNA干擾小鼠肝細(xì)胞后抑制了TGF-β1誘導(dǎo)EMT和Ⅰ型膠原的表達(dá)，且依然保留上皮化表型 (E-鈣黏附蛋白)和功能(白蛋白)。

圖3 TGF-β1誘導(dǎo)后HL7702細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)Fig3 Expression of EMT-associated proteins after TGF-β1 induced in HL7702 cells

Snail-1是EMT的關(guān)鍵分子，那么如果封閉Snail-1轉(zhuǎn)錄因子之后，是否會(huì)抑制TGF-β1誘導(dǎo)人肝細(xì)胞發(fā)生EMT?TGF-β1/Smads信號(hào)通路是EMT發(fā)生的重要信號(hào)通路，那么Smad4-siRNA干擾之后，即使肝細(xì)胞在TGF-β1作用下也不會(huì)發(fā)生EMT嗎?這些問(wèn)題將是在此基礎(chǔ)上我們今后要研究的內(nèi)容。

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