HPLC-UV法測定大鼠腦組織中5-羥色胺含量

張遠(yuǎn)冬 張有金 郭延壘 劉學(xué)慶 于超

5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)亦稱血清素(Serotonin)，是人體內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，其參與睡眠、攝食、體溫、學(xué)習(xí)、記憶等多種生理過程［1］。中樞神經(jīng)系統(tǒng)5-HT含量異常與重性抑郁障礙(major depressive disorder，MDD)和自殺行為有著極其重要的聯(lián)系［2，3］，同時也可以影響血腦屏障通透性的改變［4］。因此定量測定5-HT在腦組織中的含量對精神情感性疾病、腦血管疾病等的發(fā)病機制的研究具有重要參考價值。

據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報道，5-HT含量測定的方法有生物法、免疫法［5，6］、熒光分光光度法［7］、高效液相-電化學(xué)色譜法(HPLCECD)、高效液相-熒光色譜法(HPLC-FLD)、高效液相-紫外色譜法(HPLC-UV)等［8］。目前，在大多數(shù)實驗研究中都采用準(zhǔn)確、高效、簡便快速的液相色譜法，其中，HPLC-UV法以其儀器成本較低、操作簡單、維護(hù)簡便，因而在實驗室中應(yīng)用較為廣泛，使用頻率大大高于HPLC-ECD和HPLC-FLD。此外，HPLC-UV法常用于血清中5-HT含量的測定，但對于大鼠腦組織中5-HT含量的測定鮮有報道，因此本實驗采用HPLC-UV法，建立了快速穩(wěn)定、準(zhǔn)確可靠的測定大鼠腦組織中5-HT含量的方法，為5-HT等相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)類疾病的臨床研究提供重要參考方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 高效液相色譜儀(SHIMADZU LC-2010AHT);Z233MK型高速冷凍離心機(德國HEMNLE公司);3240025組織勻漿機(德國IKA公司);XS-105十萬分之一精密電子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司);SB-3200DT超聲波清洗機(寧波新芝公司);SEVEN Multi PH計(瑞士METTLER TOLEDO公司);Elix10超純水凈化系統(tǒng)(美國MILLIPOER公司);01730微孔過濾器(美國MILLIPORE公司)。

鹽酸-5-羥色胺(Serotonin hydrochloride，美國 SIGMAALORICH公司，批號:H9523-25MG);甲醇為色譜純(美國TEDIA公司)，水為超純水，其他試劑均為市售分析純。

1.2 色譜條件 色譜柱為SHIMADZU VP-ODS C18柱(250×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇-0.01 mol/L的醋酸鉀緩沖液(10:90，V/V，用0.2 mol/L檸檬酸調(diào)pH至4.00)等度洗脫，柱溫:25℃，流速:1.00 ml/min，檢測波長:275 nm。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 精密稱取5-HT標(biāo)準(zhǔn)品1.480 mg于容量瓶中，加超純水溶解并定容，制成1 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，避光，-20℃冷藏保存。按實際檢測需要稀釋到相應(yīng)的濃度，供檢測用。

1.4 樣品來源及制備 清潔級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠5只，每只平均體重為200±20 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物質(zhì)量合格許可證號為SCXK(渝):2007-0002。

大鼠斷頭處死后取整個腦組織，稱濕重，以1∶15加入PBS(1 mol/L磷酸氫二鉀:1 mol/L磷酸二氫鉀=80:20混合)，于冰浴中充分勻漿后混勻。為選擇合適的蛋白沉淀劑，將勻漿液分為三份，分別加入勻漿液體積一半量的乙腈、10%三氯乙酸、10%高氯酸沉淀蛋白。充分渦旋后，在4℃下以12000 rpm離心15 min后精密吸取上清液200 μl，用10 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7.0，過0.45 μm濾膜后于 -80℃保存待測

2 結(jié)果

2.1 專屬性考察 為確定流動相的最適pH值，分別考察了醋酸鉀緩沖液pH值在5.00、4.50、4.00時的色譜峰峰形及峰高，結(jié)果如圖1所示，pH在5.00和4.50時，峰形較寬，且有嚴(yán)重拖尾，當(dāng)pH為4.00時，峰型良好，拖尾得到了良好的改善，因此確定緩沖液pH為4.00，與甲醇比例為90:10(V/V)進(jìn)行等度洗脫，結(jié)果如圖2所示，5-HT峰形良好，且無內(nèi)源性物質(zhì)干擾，其保留時間為9.3 min。

2.2 線性范圍與最低檢測限 精密量取5-HT標(biāo)準(zhǔn)品儲存液各20 μl，分別加入超純水稀釋，配成濃度為 0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。在此色譜條件下進(jìn)樣測定，以面積A為縱坐標(biāo)(Y)，以濃度C(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為 A =46008.89C +1886.58(r=0.9999)，表明5-HT 在0.1 ～20 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，適合于5-HT含量的測定;5-HT的最低檢測限(LOD)為40 ng/ml(S/N＞3)。

2.3 精密度實驗 精密吸取5-HT標(biāo)準(zhǔn)品溶液各20 μl，分別加超純水稀釋，制成高、中、低三種濃度為7.5、1.5、0.15 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液200 μl，于第1 d各測定5次，每次進(jìn)樣20 μl，計算當(dāng)日內(nèi)峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，考察日內(nèi)精密度;同時連續(xù)測定3 d，計算3 d內(nèi)峰面積RSD，考察日間精密度。結(jié)果如表1所示，各濃度的日內(nèi)、日間RSD均小于3%;表明此實驗方法精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性考察 精密量取5-HT標(biāo)準(zhǔn)品溶液各20 μl，制成高、中、低3 種濃度為7.5、1.5、0.15 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液800 μl，平行制備兩組，一組置于室溫保存，另一組置于-20℃保存，并于第1、2、3、5、7天連續(xù)進(jìn)樣，每日各測定5 次，記錄峰面積，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線求得測定濃度，計算一周內(nèi)所測濃度的RSD，考察5-HT的穩(wěn)定性。結(jié)果如表2及表3所示，室溫和凍融實驗下5-HT各濃度RSD均小于3%;說明5-HT在室溫和凍融試驗中均較穩(wěn)定，易于保存。

2.5 加樣回收率考察 精密吸取未經(jīng)蛋白沉淀處理的大鼠腦組織勻漿液3份，再精密加入特定體積的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，制成含標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為0.19、0.16、0.13 μg/ml的待測液溶液各200 μl，每一濃度平行制備3組，每組重復(fù)測定5次，考察其加樣回收率。按公式:回收率=(測定液測定值-原樣液含測值)/加入量值×100%，計算大鼠腦組織中5-HT加樣回收率。結(jié)果如表4所示，所測得范圍為89.62% ～101.6%，符合生物樣品測定要求，說明此色譜條件下所測得的5-HT含量準(zhǔn)確度較好。

圖1 不同pH值下的5-HT色譜圖

圖2 5-HT色譜圖

表1 日內(nèi)、日間精密度考察結(jié)果(n=5)

表2 室溫穩(wěn)定性(n=5)

表3 凍融穩(wěn)定性(n=5)

表4 5-HT加樣回收率(n=5)

2.6 樣品含量的測定 取大鼠腦組織樣品，按“1.4”項下方法操作，平行制備3組，并在此色譜條件下進(jìn)行測定，照外標(biāo)法計算，測得該組織樣品中5-HT含量為(0.2715±28)μg/g。

3 討論

在以往研究中，5-HT的含量測定方法眾多，其中，免疫法實驗條件要求高;熒光分光光度法操作復(fù)雜，數(shù)據(jù)讀取時誤差大，故其應(yīng)用均受到較大限制;HPLC-ECD、HPLC-FLD、HPLC-UV法現(xiàn)已是國內(nèi)外測定5-HT較為常用的方法。前二者雖然靈敏度高，但HPLC-ECD法測定時，儀器系統(tǒng)在分析前對樣品進(jìn)行鈍化要求高［9］，電化學(xué)工作電極容易受污染且其樣品極易受其他物質(zhì)干擾，需嚴(yán)格控制測定過程來減少干擾［10］;同時其流動相組成常含有高濃度離子對試劑，對柱子傷害較大。而在HPLC-FLD法中，同樣由于檢測器成本昂貴，大大限制了其使用。本實驗采用HPLC-UV法，建立了穩(wěn)定快速的大鼠腦組織中5-HT的含量測定方法，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用于臨床和科研對5-HT大樣本量的檢測。

本實驗在參考文獻(xiàn)［11］的基礎(chǔ)上，對檢測方法進(jìn)行了流動相比例、pH值、離子強度等的優(yōu)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)5-HT色譜峰在流動相為4.00時峰形良好，且無內(nèi)源性物質(zhì)的干擾;在流動相的配制上，選用10 mmol/L的醋酸鉀溶液，并以0.20 mol/L的檸檬酸調(diào)節(jié)pH至4.00的方法，降低了緩沖鹽離子強度，減小了緩沖鹽體系對柱子的損傷程度。

在樣品制備過程中，本文進(jìn)行了蛋白沉淀試劑的優(yōu)化，比較了乙腈、10%三氯乙酸、10%高氯酸的蛋白沉淀效果。發(fā)現(xiàn)乙腈和10%的三氟乙酸沉淀蛋白時均出現(xiàn)嚴(yán)重的干擾峰，而10%的高氯酸沉淀時無蛋白峰干擾，且5-HT色譜峰峰形良好。由于高氯酸有很強的氧化性，對柱子損害較大，因此進(jìn)樣前需調(diào)節(jié)樣品溶液pH值至7.0左右，以降低其對分析柱的損傷。

［1］林凌云，李慧，許崇濤，等.HPLC-熒光法測定大鼠腦組織中的單胺類神經(jīng)遞制質(zhì)及相關(guān)物質(zhì).華西藥學(xué)雜志，2007，22(5):557-558.

［2］Rodrigo A，Espana，Thomas E，et al.Sleep Neurobiology from a Clinical Perspective.SLEEP，2011，34(7):845-858.

［3］Neves FS，Malloy-Diniz LF，Romano-Silva MA，et al.Is the serotonin transporter polymorphism(5-HTTLPR)a potential marker for suicidal behavior in bipolar disorder patients.J Affect Disorders，2010，125(1-3):98-102.

［4］Kemaldo P，de Vries Elisabeth GE，Muskiet FA，et al.Clinical chemistry of serotonin and metabolites.J Chromatogr B:Biomed Sci Appl，2000，747(1-2):33-48.

［5］黃建國，陸世華，王曉春.酶免試驗法測定全血5-羥色胺.臨夏醫(yī)學(xué)雜志，2002，24(9):545-546.

［6］李建剛，張巧俊，高敬龍，等.腦卒中后抑郁患者5-羥色胺含量的研究.中國臨床神經(jīng)科學(xué)，2007，15(2):129-132.

［7］張秀明，顧仁俊，張中興，等.熒光分光光度法測定血清5-羥色胺的實驗研究及臨床應(yīng)用.陜西醫(yī)學(xué)檢驗，2009，9(1):14-16.

［8］魯燕俠，崔佳藺，興謠，等.RP-HPLC-熒光檢測法測定小鼠腦組織中5種神經(jīng)遞質(zhì)的含量.解放軍藥學(xué)學(xué)報，2003，19(4):262.

［9］譚炳炎，鄭琳，馮翔.高效液相色譜/電化學(xué)法測定大鼠血液和腦組織中單胺類物質(zhì)的含量.分析測試學(xué)報，2006，25(2):90-92.

［10］張向暉，劉軍，蘇林雁.庫侖陣列電化學(xué)高效液相色譜法測定大鼠腦組織中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及代謝產(chǎn)物.醫(yī)學(xué)臨床研究，2007，24(1):1-3.

［11］Brazelll MP，Marsden CA，Nisbet AP，et al.The 5-HT 1 receptor agonist RU-24969 decreases 5-hydroxytryptamine(5-HT)release and metabolism in the rat frontal cortex in vitro and in vivo.Br J Pharmacol，1985，86(1):209-216.