銀杏果多糖樹脂脫色工藝

楊強(qiáng)，李新華，林子木

1(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽，110866)2(遼寧省糧食科學(xué)研究所，遼寧 沈陽，110032)

銀杏是世界上十分珍貴和古老的樹種之一，有“活化石”之美稱。我國園藝學(xué)家們也常常把銀杏與牡丹、蘭花相提并論，譽(yù)為"園林三寶"。銀杏果是銀杏樹的種子，因其中種皮為白色的硬殼，故俗稱白果［1］。銀杏果中含有豐富的營養(yǎng)成分和特異的化學(xué)物質(zhì)，多糖就是銀杏果中一種重要的活性成分。近年來研究發(fā)現(xiàn)，多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗衰老、抗腫瘤、降血糖等多種活性作用。但除蛋白后的銀杏果多糖色澤呈橘黃色，其色澤不僅會影響到多糖的純度，還會影響到多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及生物活性的研究。因此，對銀杏果多糖進(jìn)行脫色，不僅能改善多糖的外觀，而且還能為深入研究其結(jié)構(gòu)等打下基礎(chǔ)［2］。本文探討了離子交換樹脂和大孔吸附樹脂對銀杏果多糖的脫色情況，采用靜態(tài)吸附和動態(tài)吸附試驗確定了樹脂的種類，優(yōu)化了脫色工藝，取得了較好的效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

銀杏果多糖(實驗室提取);脫色1號、D900、D101、HD-8、NKA9、DA-201、AB-8、S-8 型大孔樹脂(滄州寶恩吸附材料科技有限公司)。

1.2 儀器設(shè)備

7200 型分光光度計(尤尼柯(上海)儀器有限公司);JD200-2型電子天平(北京塞多利斯儀器有限公司);數(shù)顯式恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司);TDL-5-A型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);DZF-6050真空干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司);HL-2恒流泵(上海青浦滬西儀器廠)。

1.3 實驗方法

1.3.1 樹脂的預(yù)處理

陽離子交換樹脂→質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%NaCl浸泡20 h→去離子水清洗至中性→質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%NaOH浸泡4 h→去離子水沖洗至中性質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%HCl浸泡4 h→去離子水沖洗至中性→烘箱中50℃烘干備用。

陰離子交換樹脂→質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%NaCl浸泡20 h→去離子水清洗至中性→質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%HCL浸泡4 h→去離子水沖洗至中性→質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%NaOH浸泡4 h→去離子水沖洗至中性→烘箱中50℃烘干備用。

吸附樹脂→質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%HCl浸泡20 h→去離子水清洗至中性→質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%NaOH浸泡4 h→去離子水沖洗至中性→質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%乙醇浸泡12 h→去離子水清洗至無醇味→烘箱中50℃烘干備用。

1.3.2 靜態(tài)吸附實驗

1.3.2.1 大孔樹脂脫色方法

取一定量處理好的樹脂，加入30 mL 2%的銀杏果多糖溶液于100 mL三角瓶中，恒溫振蕩2 h(120 r/min)。振蕩結(jié)束后，雙層濾紙過濾，5000 r/min離心20 min，考察不同樹脂對多糖溶液的脫色率、總糖保留率和蛋白質(zhì)去除率。

1.3.2.2 正交實驗

100 mL三角瓶中分別加入30 mL 2%的pH值為4.5、5.5和6.5的銀杏果多糖溶液和一定量處理好的脫色1號、D900和D101樹脂，然后將三角瓶置于25、35、45℃的恒溫振蕩箱中振蕩2 h(120 r/min)，振蕩結(jié)束后，濾紙過濾多糖溶液，溶液經(jīng)5 000 r/min離心20 min后，考察不同樹脂對提取液的脫色率、總糖保留率和蛋白質(zhì)去除率。

1.3.3 動態(tài)吸附實驗

1.3.3.1 上柱速度對脫色效果的影響

裝柱體積1BV，配制2 mg/mL的脫蛋白后的多糖溶液 1BV 上樣，選擇上樣速度為0.5，l，1.5，2.0，2.5 mL/min，再用2BV的蒸餾水淋洗，合并多糖脫色液和洗脫液，分別測其多糖、色素、蛋白質(zhì)的含量，考察上樣流速對吸附效果的影響。

1.3.3.2 上樣濃度對脫色效果的影響

裝柱體積1BV，分別稱量1 g粗多糖配成1、2、3、4、5、6 mg/mL的粗多糖溶液上柱，流速為1.5 mL/min，后用2BV的蒸餾水沖洗，合并多糖脫色液和洗脫液，分別測其多糖、色素、蛋白質(zhì)的含量，考察上樣濃度對吸附效果的影響。

1.3.3.3 柱容量對脫色效果的影響

在上柱速度為1.5 mL/min，上柱濃度為4 mg/mL條件下，考察脫色1號的柱容量。

1.3.4 分析方法

1.3.4.1 多糖測定及保留率的計算

采用苯酚-硫酸法［3］，以葡萄糖為對照品。線性回歸方程為:A=13.961c+0.0449，相關(guān)系數(shù) r=0.999。式中:A為吸光度;c為以葡萄糖計的多糖濃度(mg/mL)。

式中:m前、m后分別為脫色前后的多糖總量。

1.3.4.2 脫色率測定及計算方法

經(jīng)脫色后的待測的多糖提取液雙層濾紙過濾，5 000 r/min 離心20 min 后，分別在420、520、620 nm處測其的吸光值。

式中:OD總前、OD總后分別為脫色前后溶液在420、520、620 nm處測得的吸光值的和。

1.3.4.3 蛋白質(zhì)的測定及去除率的計算

蛋白質(zhì)測定采用考馬斯亮藍(lán)G-250法［4］測定，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，線性回歸方程為A=0.042 82+0.001 34c，相關(guān)系數(shù) r=0.997 5。

式中:A為吸光度;c蛋白質(zhì)濃度(μg/mL)。

式中:c前、c后分別為脫色前和脫色后蛋白質(zhì)的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 靜態(tài)吸附法篩選樹脂實驗結(jié)果

2.1.1 樹脂的初步篩選

分別向三角瓶中加入8種一定量的樹脂和料液(30 mL)，然后放入搖床振蕩2 h(溫度45℃，轉(zhuǎn)速120 r/m in)。脫色后，濾紙過濾多糖溶液，5 000 r/min離心20 min，測定并計算料液的脫色率、總糖保留率和蛋白質(zhì)去除率，結(jié)果如表所示。

由表1可知，脫色1號、D900、DA-201C、D101四種樹脂的脫色率都在50%以上，多糖保留率也在65%以上，但 D101樹脂的蛋白質(zhì)去除率卻只有51.07%，所以選擇脫色1號、D900、DA-201C樹脂進(jìn)行正交試驗，對樹脂脫色條件進(jìn)一步優(yōu)化。

以上8種被考察的樹脂對色素、多糖、蛋白質(zhì)的吸附各不相同，這與樹脂的性能和被吸附物質(zhì)的性質(zhì)有很大的關(guān)系。從樹脂性質(zhì)上看，樹脂脫色1號、D900屬于陰離子交換樹脂，樹脂HD-8屬于陽離子交換樹脂，樹脂脫色1號、D900的脫色效果優(yōu)于樹脂HD-8，表明銀杏果多糖提取液中的色素可能屬于陰離子型。從樹脂極性來看，樹脂D101、DA-201為非極性樹脂，樹脂AB-8、S-8、NKA-9為極性樹脂，樹脂D101、DA-201的脫色效果明顯優(yōu)于樹脂AB-8、S-8、NKA-9，表明銀杏果多糖提取液中的色素可能屬于非極性分子。此外，樹脂聚合體所具有的網(wǎng)眼大小必須與銀杏果多糖中所含色素分子的大小相適應(yīng)，才能達(dá)到吸附效果，而脫色效果較差的樹脂NKA-9孔徑最大，由此推測銀杏果多糖溶液中色素主要為小分子。綜合分析銀杏果多糖提取液中的色素可能以帶負(fù)電荷的非極性小分子色素為主。

2.1.2 正交設(shè)計確定脫色的最佳工藝條件

采用正交試驗法確定銀杏果多糖溶液的最佳脫色條件，設(shè)計三因素三水平L9(33)正交試驗表，見表2。

表2 試驗因素水平表L9(33)

表3 正交試驗結(jié)果表

由表3可知，影響多糖脫色率的因素依次為A＞B＞C，即樹脂種類＞pH值＞溫度，最優(yōu)組合為A1B1C2，即樹脂種類為脫色1號，pH值為4.5，溫度為35℃;影響多糖保存率的因素依次為A＞C＞B，即樹脂種類＞溫度＞pH值，最優(yōu)組合為A1B1C3，即樹脂種類為脫色1號，pH值為4.5溫度為45℃;影響蛋白去除率的因素依次為A＞B＞C，即樹脂種類＞pH值＞溫度，最優(yōu)組合為A1B3C1，即樹脂種類為脫色1號，pH值為6.5，溫度為25℃。

綜合考慮脫色率、總糖保留率、蛋白質(zhì)去除率3個指標(biāo)，得出最佳脫色條件為:脫色1號樹脂、pH值為4.5、溫度為25℃。

2.2 動態(tài)吸附實驗結(jié)果

2.2.1 上柱速度對脫色效果的影響

將濃度為2.0 mg/mL的銀杏果多糖溶液以0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min 的流速分別上樣，然后測其脫色率，結(jié)果見圖1。

圖1 上樣速度對樹脂脫色的影響

由圖1可知，隨著上柱速度的增加，多糖的脫色率逐漸下降。當(dāng)上樣速度為0.5、1.0 mL/min時，脫色率非常高;當(dāng)上樣速度為2.0 mL/min時，脫色率明顯下降。從吸附理論可以解釋，流速越慢，有利于上柱液中色素分子與樹脂表面充分進(jìn)行粒擴(kuò)散和膜擴(kuò)散，使色素分子充分被樹脂吸附;同時，流速過快，樹脂與多糖溶液接觸的時間越短，不能充分吸附其中色素，因而脫色效果較差。因此選擇上柱速度為1.5 mL/min。

2.2.2 上樣濃度對脫色效果的影響

配制濃度為 1，2，3，4，5，6 mg/mL 的銀杏果多糖溶液分別上樣，然后測其脫色率，結(jié)果見圖2。

圖2 上樣濃度對樹脂脫色的影響

由圖2可知，銀杏果多糖總量一定時，濃度越大，脫色率越低。但是當(dāng)多糖總量一定時，濃度較高的多糖溶液由于體積小反而可以縮短脫色時間，提高生產(chǎn)效率。當(dāng)多糖濃度為5 mg/mL時，脫色率明顯下降。綜合考慮脫色率以及后續(xù)試驗的濃縮工作考慮，選擇4 mg/mL濃度的銀杏果多糖溶液脫色較為合適。

2.2.3 柱容量對脫色效果的影響

在上柱速度為1.5 mL/min，上柱濃度為4 mg/mL條件下，考察脫色1號的柱容量，結(jié)果見圖3。

圖3 柱容量對樹脂脫色的影響

由圖3可知，隨著上樣量的增大，脫色率在逐漸的降低。當(dāng)上樣量在2BV時，多糖的脫色率為90.0%，當(dāng)上樣量為3BV時，脫色率也在80%以上，說明脫色1號具有較強(qiáng)的脫色能力。因此，選擇上樣量為2BV。

2.3 驗證試驗

綜合靜態(tài)和動態(tài)吸附試驗的結(jié)果進(jìn)行3次驗證試驗，結(jié)果表明在采用脫色1號樹脂，pH值為4.5，溫度為25℃，上柱速度為1.5 mL/min，上樣濃度為選擇4 mg/mL，柱容量為2BV的條件下，多糖的脫色率為82.37%，多糖保留率為79.12%，蛋白去除率為88.39%。

3 結(jié)論

(1)采用離子交換樹脂和吸附樹脂對銀杏果多糖進(jìn)行脫色，篩選出3種樹脂:大孔陰離子交換樹脂脫色1號、D900和非極性的大孔吸附樹脂DA-201C。

(2)銀杏果多糖中的色素可能以帶負(fù)電荷的非極性小分子色素為主。

(3)通過正交試驗和動態(tài)吸附試驗對脫色條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，在采用脫色1號樹脂，pH值為4.5，溫度為25℃，上柱速度為1.5mL/min，上樣濃度為選擇4 mg/mL，柱容量為2BV的條件下，多糖的脫色率為82.37%，多糖保留率為79.12%，蛋白去除率為88.39%。

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