油茶籽殼原花青素的分離純化*

余紅軍，鄭生宏，李立祥

1(浙江綠世界生物工程有限公司，浙江湖州，313300)2(浙江麗水市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江麗水，323000)3(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉生物化學(xué)與生物技術(shù)教育部、農(nóng)業(yè)部重點實驗室，安徽合肥，230036)

原花青素(proanthocyanidins，簡稱PC)是由單體黃烷-3-醇類物質(zhì)以不同聚合度連接而成的多酚類化合物，有人將其歸為縮合鞣質(zhì)［1－3］。這類化合物由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素結(jié)合而成，最簡單的是兒茶素、表兒茶素或兒茶素與表兒茶素形成的二聚體，此外還有三聚體、四聚體等直至十聚體［4－5］。研究表明，原花青素具有廣泛的生化和藥理活性，如抗氧化、清除自由基、護肝解毒、抗菌及抗癌等功能;目前已經(jīng)成為醫(yī)藥、保健品的重要原料及食品、化妝品的重要添加劑;它廣泛存在于各種植物(如葡萄、銀杏、白樺樹等)的核、殼、種籽中［6－7］。

目前，國內(nèi)外學(xué)者對原花青素的研究主要集中在葡萄籽、沙棘、山楂等材料［8，9］，對油茶籽殼中原花青素的研究較少，而中國油茶(Camellia oleifera Abel)資源豐富，據(jù)統(tǒng)計，全國現(xiàn)有油茶面積400多萬hm2，年產(chǎn)油茶籽60萬t，因此，充分利用油茶籽資源，不僅變廢為寶，且還會帶來巨大的經(jīng)濟效益［10－11］。本文利用Sephadex LH－20柱色譜分離純化油茶籽殼原花青素，并對柱層析純化得到的原花青素進行分析和鑒定，為油茶籽殼中原花青素的進一步研究和應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

油茶籽殼，安徽黃山謝裕大茶業(yè)有限公司提供;原花青素對照品(天津尖峰天然產(chǎn)物有限公司，源自葡萄籽，純度＞95%);GA(沒食子酸)、GC(沒食子兒茶素)、EGC(表-沒食子兒茶素)、C(兒茶素)、EC(表-兒茶素)、EGCG(表-沒食子兒茶素酸酯)、ECG(表-兒茶素沒食子酸酯)，Sigma公司;色譜級甲醇、乙腈、醋酸(美國Tedia公司);香草醛(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所);乙醇(分析純，上海振企化學(xué)試劑有限公司);葡聚糖凝膠Sephadex LH-20(Pharamacia biotech公司);其他試劑均為分析純，水為去離子水。

1.2 主要儀器

UV－2102C型紫外可見分光光度計(上海尼龍科儀器有限公司);U3010紫外分光光度計(日本日立公司);DHG－9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司);HH－6型電熱恒溫水溶鍋(江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司);KQ－500DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);Waters－600高效液相色譜儀(美國Waters公司);LGJ－12冷凍干燥機(北京松源華興科技發(fā)展有限公司)AB104-N型電子天平(Mettlet-Toledo Group);SENCO R系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司);JFSD－100粉碎機(上海嘉定糧油儀器有限公司);BECKMAN COULTER Avanti J－30I型高速冷凍離心機(美國貝克曼公司);層析柱(2.5 cm×50 cm，上海錦華實驗器械廠)。

1.3 實驗方法

1.3.1 材料的預(yù)處理

將油茶籽殼放于烘箱中40℃條件下烘4 h，取出后用粉碎機粉碎至100目，后置于干燥器中備用。

1.3.2 原花青素的提取［12］

準(zhǔn)確稱取2.0 g100目的油茶籽殼粉于100 mL具塞三角瓶中，按1∶70(g∶mL)的料液比加入體積分?jǐn)?shù)(下同)60%的乙醇溶液140 mL，在60℃下用300 W的超聲功率浸提30 min，后冷卻至室溫，離心(5 000 r/min，10 min，常溫)，取上清液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(60℃)濃縮至1/10體積左右，然后加入4倍體積的95%乙醇，攪拌均勻后置4℃冰箱中靜置12h，離心(5 000r/min，10min，4℃)，上清液即為原花青素粗提液。

1.3.3 原花青素的 Sephadex LH－20凝膠柱純化［13］

葡聚糖凝膠Sephadex LH－20預(yù)先用體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇充分溶脹，緩慢倒入層析柱(2.5 cm×50 cm)，使其均勻沉降，用60%乙醇平衡柱床，凝膠柱床體積為230 mL。將1.3.2中的原花青素粗提液45℃真空濃縮至5 mL，用一次性吸管逐滴將樣液緩慢加入到柱床表面，待樣品完全滲入凝膠后，依次用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇、60%丙酮洗脫，流速1.0 mL/min，自動部分收集儀每5.3 min收集一管，每隔5管檢測A500(原花青素的香草醛-鹽酸法吸收峰)，繪制洗脫曲線。將兩種流動相洗脫下來的組分分別收集，真空冷凍干燥得樣品1和樣品2。

1.3.4 原花青素的分析鑒定

1.3.4.1 可見分光光度分析

以試劑空白作參比，利用香草醛-HCl法［12］，每隔5管測定洗脫液吸光值，以洗脫體積/mL為橫坐標(biāo)，A500為縱坐標(biāo)，繪制Sephadex LH－20洗脫曲線。

1.3.4.2 原花青素的含量測定

將真空冷凍干燥得到的樣品1和樣品2分別稱重，計算得率。

樣品得率=樣品質(zhì)量(mg)/2.0(g)

同時，用60%乙醇分別將樣品1、樣品2全部溶解，利用香草醛-HCL法［12］得出樣品溶液中原花青素的濃度，從而計算出樣品1、樣品2的純度。

純度/%=［N×V×/樣品質(zhì)量(mg)］×100

式中:N，樣品溶液中原花青素的濃度(mg/mL);V，樣品溶液總體積(mL)。

1.3.4.3 紫外光譜分析［14］

將樣品1溶液、樣品2溶液和用60%乙醇溶解的原花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在200～400 nm內(nèi)進行紫外光譜掃描，觀察所得圖譜在280 nm處是否有特征吸收峰。

1.3.4.4 花青素反應(yīng)［15］

取適量原花青素標(biāo)準(zhǔn)品、樣品1溶液、樣品2溶液，利用正丁醇-鹽酸法比色，觀察溶液顏色變化，同時在500～700 nm內(nèi)進行波段掃描，觀察所得圖譜在550 nm處是否有吸收峰。

1.3.4.5 油茶籽殼原花青素的HPLC分析

標(biāo)樣:7種兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品，原花青素標(biāo)準(zhǔn)品。

HPLC色譜條件:Waters600泵，2489 Dual Absorbance Detector，LCsolution液相色譜工作站;色譜柱:大連Elite Hypersil ODS-C18柱(250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm);流動相:A相為2%的色譜級醋酸水溶液，B相為乙腈;流速:1.0 mL/min;柱溫:30℃;檢測波長:280 nm;進樣量:5 μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 油茶籽殼原花青素高效液相色譜梯度洗脫程序

2 結(jié)果與分析

2.1 Sephadex LH－20洗脫特性

由圖1可以看出，Sephadex LH－20分部洗脫分離原花青素組分，在A500處有2個大的洗脫峰，將其真空冷凍干燥，得樣品1(39 mg)和樣品2(24.2 mg)，然后對各分離組分進行檢測分析。

圖1 Sephadex LH－20動態(tài)洗脫曲線

2.2 原花青素含量測定

樣品1得率=19.5 mg/g，純度3.8%;樣品2得率12.1mg/g，純度57.3%。說明60%乙醇溶液洗脫部分的原花青素含量低，可能主要為單體兒茶素及其他水溶性成分［13］;而主要的原花青素部分由60%丙酮溶液洗脫下來，這表明60%丙酮洗脫原花青素的效果較好。

2.3 紫外光譜分析

原花青素標(biāo)準(zhǔn)品在280 nm處有最大吸收峰，由圖2可知，樣品2也在280 nm處有最大吸收，而樣品1由于原花青素純度低，與標(biāo)準(zhǔn)品溶液的光譜圖略有偏差。

圖2 樣品和PC標(biāo)準(zhǔn)品的紫外掃描圖譜

2.4 花青素反應(yīng)

原花青素在酸性條件下加熱生成最大吸收波長在550 nm附近的紅色花青素，此法對原花青素具有專一選擇性，也是一種測定原花青素含量的較好方法。

對樣品1和樣品2進行花青素反應(yīng)，結(jié)果表明，樣品1反應(yīng)后顯淡棕色，樣品2和原花青素標(biāo)準(zhǔn)品均呈現(xiàn)紅色。此外，從圖3的掃描圖譜中也可以看出，原花青素標(biāo)準(zhǔn)品進行花青素反應(yīng)后，在550 nm處有最大吸收峰，樣品2亦在550 nm處呈現(xiàn)特征吸收值，而樣品1可能由于原花青素的含量較低，未呈現(xiàn)特征峰值。

圖3 樣品和PC標(biāo)準(zhǔn)品Porter反應(yīng)后的掃描圖譜

2.5 樣品的HPLC分析

樣品1、樣品2溶液經(jīng)HPLC檢測，對所得色譜圖與兒茶素混合標(biāo)準(zhǔn)品及原花青素標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖進行比較分析。

由圖4可知，兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品的GA、C、EC、EGCG、ECG與原花青素標(biāo)品組分的保留時間相同，結(jié)合文獻報道［16］，可以推斷原花青素標(biāo)品含有 GA、C、EGCGG、ECG等兒茶素組分。

圖4 七種兒茶素標(biāo)品和原花青素標(biāo)品的色譜圖

從圖5中可以看出，樣品中的物質(zhì)比較復(fù)雜，樣品1、2與原花青素標(biāo)品在GA、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ位置均有相同的保留時間;樣品2與原花青素標(biāo)品在ECG位置有相同的出峰時間;因此，可以推斷油茶籽殼中可能存在原花青素的單體物質(zhì)(GA、ECG等)。

圖5 樣品和原花青素標(biāo)品的色譜圖

3 結(jié)論

采用Sephadex LH－20凝膠柱純化油茶籽殼原花青素粗品，使用60%的丙酮水溶液作為洗脫液洗脫效果較好，所洗脫出的原花青素含量達57.3%，遠(yuǎn)高于60%乙醇洗脫出的原花青素含量(3.8%)。

通過對樣品進行光譜掃描和花青素反應(yīng)，初步推斷洗脫出的樣品含有原花青素，高效液相色譜分析表明，從Sephadex LH－20洗脫下來的樣品組分可能含有原花青素的單體物質(zhì)(GA、ECG)。

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