高鹽負(fù)荷上調(diào)SHR胸主動(dòng)脈、腸系膜上動(dòng)脈壁AT1和AT2受體表達(dá)實(shí)驗(yàn)研究＊

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科（西安710061）

呂 穎 孫超峰△ 殷艷蓉 張軍波 潘軍強(qiáng) 韓穩(wěn)琦 周 鑫 楊 琳＃

鹽是高血壓的一個(gè)重要環(huán)境因素，高鹽攝入大動(dòng)脈彈性的增齡性改變以及對(duì)血管局部腎素-血管緊張素系統(tǒng) RAS的影響［1］。

血液循環(huán)中的腎素-血管緊張素系統(tǒng)RAS通過(guò)對(duì)血容量及外周阻力的控制，調(diào)節(jié)機(jī)體的血壓及水、電解質(zhì)平衡，而局部RAS參與細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育，在血壓維持及高血壓病的發(fā)生發(fā)展中起著極其重要的作用。血管局部RAS中最主要的效應(yīng)物AngⅡ（血管緊張素Ⅱ）質(zhì)參與大動(dòng)脈僵硬化的形成［2］。AngⅡ與AT1（血管緊張素Ⅱ的1型受體）結(jié)合后，除強(qiáng)有力的血管收縮作用、促醛固酮分泌之外，能刺激細(xì)胞因子如TGF-B（轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-B）、骨橋蛋白等的產(chǎn)生，促進(jìn)細(xì)胞增殖和肥大，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)積聚，還有促纖維化和促炎癥反應(yīng)的作用。AT2（血管緊張素II的2型受體）可能在病理狀態(tài)下的心血管系統(tǒng)中存在過(guò)表達(dá)，對(duì)抗AngⅡ通過(guò)AT1介導(dǎo)的生物效應(yīng)，參與血管舒張、抑制增殖、促進(jìn)凋亡及組織分化［3］，現(xiàn)報(bào)告如下。

材料與方法

1 材 料 51周齡組雄性SHR共60只（第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），0.4%NaCl及4%NaCl飼料由西安交大醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心配置。試劑來(lái)源：一抗①Anti-Human AT2cat＃AT21-A，Aff.Pure Bat.＃3369A4 100ug低壓凍干粉adi4生物制劑公司，②Anti-RAT AT1cat＃AT11-A，Aff.Pure Bat.＃332930A2L100ug／100ul溶液adi4生物制劑公司；二抗試劑盒：SA1022即用型SABC免疫純化試劑盒兔IgG1／2KIT（武漢博士德生物工程有限公司）；DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。鼠尾測(cè)壓儀為RBP-I型大鼠血壓心率測(cè)定儀（中日友好醫(yī)院臨床研究所制造）。

2 方 法

2.1 測(cè)血壓：所有動(dòng)物自由飲水，環(huán)境12∶12h光暗循環(huán)，溫度：18～25℃，濕度：45%～65%，氨濃度：＜20mg／L，換氣量：1.27m／h。兩組SHR大鼠預(yù)適應(yīng)1w后應(yīng)用鼠尾血壓計(jì)檢測(cè)尾動(dòng)脈收縮壓（SBP），測(cè)量3次，取平均值。干預(yù)后，再次檢測(cè)SBP。

2.2 標(biāo)本固定、取材、包埋及染色：SHR大鼠末次測(cè)血壓后第二天，稱(chēng)重后苯巴比妥鈉（50mg／kg）麻醉，4%多聚甲醛灌注取材，后固定24h，石蠟包埋，5 μm切片后Mallory染色，免疫組化SABC法（一抗?jié)舛?∶50）測(cè)定ATR表達(dá)譜的改變，以每個(gè)視野的陽(yáng)性物質(zhì)的灰度值（gray density）表示蛋白表達(dá)水平。

2.3 圖像采集及統(tǒng)計(jì)分析：采用德國(guó)Leica公司QWin550CW圖像系統(tǒng)進(jìn)行采集與分析。Mallory三色染色：藍(lán)色膠原纖維（Ⅰ型和Ⅲ型）的累積光密度值（IOD），顯示纖維化程度。免疫組化SABC法染色：高倍鏡下，選3個(gè)血管視野，測(cè)定每個(gè)視野的陽(yáng)性物質(zhì)的灰度值（gray density）。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量對(duì)正態(tài)分布且方差齊同資料采用單因素方差分析檢驗(yàn)，各組之間兩兩比較用LSD-U法。P﹤0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 高鹽或低鹽干預(yù)前后兩組SHR收縮壓比較

高鹽或低鹽干預(yù)前高鹽及低鹽組收縮壓比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05），干預(yù)后，高鹽組收縮壓高于低鹽組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 干預(yù)前后高鹽及低鹽組SHR收縮壓的比較（±s）

表1 干預(yù)前后高鹽及低鹽組SHR收縮壓的比較（±s）

注：干預(yù)后高鹽組較低鹽組＊P＜0.05。

組 別 n 干預(yù)前SBP（mmHg）干預(yù)后SBP（mmHg）30 167±16.5161.3±10.8高鹽組 30 164±15.7190±19.3低鹽組＊

2 鹽負(fù)荷對(duì)血管壁膠原纖維的影響 高鹽或低鹽干預(yù)后，胸主動(dòng)脈及腸系膜上動(dòng)脈高鹽組IOD均高于低鹽組（P＜0.01），見(jiàn)表2、圖1。

表2 SHR低鹽組和高鹽組動(dòng)脈Mallory染色I(xiàn)OD值的比較

圖1 鹽干預(yù)對(duì)腸系膜上動(dòng)脈血管壁纖維化的影響（Mallory染色 ×100）

3 鹽負(fù)荷對(duì)血管壁ATR表達(dá)譜的影響 高鹽或低鹽干預(yù)后，胸主動(dòng)脈高鹽組AT1、AT2蛋白表達(dá)均高于低鹽組（P＜0.01），AT1／AT2比值增大（P＜0.05）；腸系膜上動(dòng)脈高鹽組較低鹽組AT1蛋白表達(dá)增加（P＜0.01），AT2蛋白表達(dá)增加（P＜0.05），AT1／AT2比值無(wú)明顯變化（P ＞0.05）；見(jiàn)表3、圖2。

表3 鹽負(fù)荷對(duì)血管壁ATR表達(dá)譜的影響（±s）

表3 鹽負(fù)荷對(duì)血管壁ATR表達(dá)譜的影響（±s）

注：表示兩亞組間比較＊P＜0.05；表示兩亞組間比較，＊＊P＜0.01。

組別AT2低鹽組 28 151±12 193±8.2 0.83±0.06 28 151±11 189±12 0胸主動(dòng)脈n AT1 AT2 AT1／AT2腸系膜上動(dòng)脈n AT1 AT2 AT1／0.79±0.12.79±0.06高鹽組 27 115±11＊＊ 180±12＊＊ 0.80±0.08＊ 27 135±22＊＊ 170±12＊

灰度值（gray degree）與圖象顏色深度呈反相關(guān)，即灰度值越大，圖象顏色深度越淺，表示蛋白的表達(dá)越少。

圖2 鹽負(fù)荷對(duì)腸系膜上動(dòng)脈血管壁AT1表達(dá)的影響（×100）

討 論

本研究中，高鹽負(fù)荷后SHR的收縮壓升高，此結(jié)果與以往的流行病學(xué)研究高鹽飲食導(dǎo)致人群血壓升高的結(jié)果一致［4］。Mallory染色顯示胸主動(dòng)脈及腸系膜上動(dòng)脈的高鹽組血管壁纖維化較低鹽組均明顯增加，與Hu等［5］低鹽負(fù)荷后脈搏波測(cè)定動(dòng)脈僵硬度降低，均提示高鹽負(fù)荷與SHR的血管壁重塑相關(guān)。

鹽是獨(dú)立于血壓、年齡、腎臟變化的導(dǎo)致血管重塑的危險(xiǎn)因素。長(zhǎng)期以來(lái)，鹽介導(dǎo)的血壓升高歸因于短期的血容量增加和長(zhǎng)期的小動(dòng)脈功能及結(jié)構(gòu)的變化所致的血管阻力增加，本研究同期實(shí)驗(yàn)也證實(shí)鹽負(fù)荷后SHR血漿中血漿C型利鈉肽（CNP）降低內(nèi)皮素-1（ET-1）升高［6］。然而，鹽介導(dǎo)的心血管系統(tǒng)的改變不僅僅局限于小動(dòng)脈，也可能存在于大的中心傳導(dǎo)動(dòng)脈及肌性中動(dòng)脈。本實(shí)驗(yàn)中，胸主動(dòng)脈及腸系膜上動(dòng)脈分別屬于中心性動(dòng)脈及肌性中動(dòng)脈，高鹽負(fù)荷導(dǎo)致在循環(huán)RAS受抑制情況下，局部ATR表達(dá)上調(diào)可能是這兩類(lèi)動(dòng)脈重塑的機(jī)制之一。Tobain［7］首次證實(shí)高鹽導(dǎo)致SHR動(dòng)脈重塑，管壁的增厚與膠原纖維的沉積及內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)功能異常有關(guān)。以上結(jié)果支持本實(shí)驗(yàn)中，鹽與大、中動(dòng)脈重塑相關(guān)，可能與血管局部?jī)?nèi)分泌系統(tǒng)激活有關(guān)。

Georg等［8］采用放免、Northern blotting和 PCR法分別從受體蛋白和mRNA水平證實(shí)了高鹽對(duì)SD大鼠主動(dòng)脈AT1表達(dá)起上調(diào)作用，同時(shí)用體外高鹽孵育血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）的結(jié)果與上述在體實(shí)驗(yàn)一致，提示高鹽負(fù)荷可能通過(guò)直接上調(diào)AT1參與了高血壓的形成。除AngⅡ外，高鹽負(fù)荷激活的血管局部醛固酮及機(jī)械應(yīng)力均可作用于AT1，醛固酮使腸系膜動(dòng)脈或VSMC的AT1二聚體蛋白水平升高，引起細(xì)胞內(nèi)谷氨酰胺酶濃度上升，引起血管收縮［9］。

病理狀態(tài)下，AT2增多，高鹽時(shí)AT2的增高可能繼發(fā)于AT1的增高，發(fā)揮一定的代償作用。有研究發(fā)現(xiàn)，血壓和局部AngⅡ增加將持續(xù)上調(diào)AT2的表達(dá)。而高鹽負(fù)荷下，SBP及組織AngⅡ表達(dá)均升高，也可能是AT2的表達(dá)持續(xù)上調(diào)的機(jī)制之一。胸主動(dòng)脈及腸系膜上動(dòng)脈的AT1和AT2在高鹽負(fù)荷時(shí)表達(dá)均上調(diào)，導(dǎo)致兩者比值無(wú)明顯變化，AT2持續(xù)發(fā)揮拮抗AT1的效應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)中高鹽負(fù)荷下，AT1蛋白在胸主動(dòng)脈及腸系膜上動(dòng)脈表達(dá)較低鹽負(fù)荷明顯增高，說(shuō)明了局部RAS系統(tǒng)在老年收縮期高血壓時(shí)大、中動(dòng)脈重塑形成和發(fā)展過(guò)程中可能起了重要作用。AT2在胸主動(dòng)脈及腸系膜上動(dòng)脈高鹽亞組表達(dá)亦顯著高于低鹽亞組。在腸系膜上動(dòng)脈，鹽負(fù)荷對(duì)AT1和AT2表達(dá)的影響較胸主動(dòng)脈更為顯著，可能與腸系膜上動(dòng)脈屬于肌性動(dòng)脈，而胸主動(dòng)脈屬于彈性動(dòng)脈，腸系膜上動(dòng)脈VSMC含量多于胸主動(dòng)脈，而AT1和AT2表達(dá)于VSMC和內(nèi)皮細(xì)胞（EC）有關(guān)。與Corriu等發(fā)現(xiàn)由正常血管壁中收縮型VsMC轉(zhuǎn)變?yōu)閾p傷血管中AT1表達(dá)增高的增殖型VSMC一致。

SHR大鼠隨著高鹽喂養(yǎng)血壓升高，胸主動(dòng)脈及腸系膜上動(dòng)脈膠原纖維沉積明顯增加；AT1及AT2表達(dá)均增加，特別是腸系膜上動(dòng)脈壁；而對(duì)AT1／AT2比值未見(jiàn)明顯影響。這一結(jié)果提示，血管壁局部ATR的改變可能是高鹽負(fù)荷導(dǎo)致血管壁重塑的機(jī)制之一，減少鹽的攝入對(duì)預(yù)防高血壓動(dòng)脈病變的發(fā)生和發(fā)展有著重要的意義。

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