正交試驗(yàn)優(yōu)選桑黃多酚超聲提取工藝Δ

馮子旺，俞力超，李峰，徐秀泉（1.江蘇大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江1013；.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇鎮(zhèn)江 1001；3.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 1013）

正交試驗(yàn)優(yōu)選桑黃多酚超聲提取工藝Δ

馮子旺1＊，俞力超2，李峰2，徐秀泉3#（1.江蘇大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇鎮(zhèn)江 212001；3.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013）

目的：優(yōu)化桑黃多酚的超聲提取工藝。方法：以乙醇濃度、超聲時(shí)間、超聲溫度和料液比為考察因素，以桑黃總多酚提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)選提取工藝。結(jié)果：最佳提取工藝為乙醇濃度60%，超聲時(shí)間30min，超聲溫度50℃，料液比1∶25。在此條件下，桑黃總多酚提取率可達(dá)26.4mg·g-1。結(jié)論：采用超聲輔助提取桑黃多酚，時(shí)間短、得率高，是一種高效、快捷的方法。

桑黃；多酚；正交設(shè)計(jì)；超聲提取

酚類化合物是植物次生代謝產(chǎn)物中的重要類型之一，主要由類黃酮、酚酸、單寧等3類物質(zhì)構(gòu)成，因其具有顯著的抗氧化、抗癌、抗炎及抗突變活性而引起人們的廣泛關(guān)注[1]。桑黃Phellinus igniarius是一種珍貴的藥用真菌，生于楊、樺等樹干上，分布于我國華北、東北、西北地區(qū)及四川、云南等省，在我國傳統(tǒng)醫(yī)藥中主要用于治療血淋、臍腹?jié)?、脫肛泄血不止、婦人勞損等證，日本則作為利尿劑使用[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，桑黃中的多酚具有顯著的抗氧化、抗腫瘤活性，是其主要的生理活性成分[3，4]，但目前少有其多酚提取工藝的報(bào)道。故筆者采用超聲輔助提取的方法，運(yùn)用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化桑黃多酚的提取工藝，為其大批量生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

UV-2550紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；DHG-9145鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）；KQ-250DB超聲波儀（昆山市超聲儀器有限公司，功率：250W，頻率：40kHz）；BS110S電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

桑黃購自吉林省千百匯土特產(chǎn)有限公司，經(jīng)江蘇大學(xué)藥學(xué)院沈絳英副主任藥師鑒定為藥用桑黃P.igniarius干燥的菌核，粉碎過16目篩，備用；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98.5%）、Folin-ciocalteu（福林酚）試劑均購自美國Sigma公司；無水乙醇、碳酸鈉等試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 桑黃總多酚含量的測(cè)定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品25.0mg，置25mL量瓶中，加乙醇適量溶解，定容，搖勻，取溶液2.5mL，用60%乙醇定容至25mL，即得 100μg·mL-1的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取1.0g桑黃粉末，加入一定濃度的乙醇溶液，在一定溫度下超聲提取規(guī)定時(shí)間，離心，殘?jiān)聪嗤绞皆俅翁崛?，合?次提取液，定容至100mL，即得。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL，置于10mL容量瓶中，分別加入福林酚試劑0.5mL，振搖1min；再加入20%碳酸鈉溶液2mL，搖勻，加蒸餾水至刻度，在室溫下放置2h。以相應(yīng)的試劑溶液為空白，參照文獻(xiàn)[5]方法，在750nm波長處測(cè)定吸光度。以吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，檢測(cè)濃度（X）為橫坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y＝0.014X－0.001（r＝0.9996，n＝6）。結(jié)果表明，沒食子酸檢測(cè)濃度在10～100μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.2 桑黃總多酚提取率的測(cè)定

精密量取供試品溶液1mL，置于10mL量瓶中，用60%乙醇定容，準(zhǔn)確吸取該溶液1.0mL，置于10mL量瓶中，按照沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定吸光度。根據(jù)回歸方程計(jì)算質(zhì)量濃度（c），按下式計(jì)算桑黃總多酚提取率：桑黃總多酚提取率（mg·g-1）＝c×10×100/1000×M（式中：10為稀釋倍數(shù)；M為稱取的桑黃粉末質(zhì)量；100為樣品體積）。

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 乙醇濃度對(duì)多酚提取率的影響 固定料液比1∶20、超聲溫度50℃、超聲時(shí)間20min，分別用30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇進(jìn)行提取，考察不同乙醇濃度對(duì)桑黃多酚提取率的影響。結(jié)果，乙醇濃度在30%～60%范圍內(nèi)，多酚提取率隨乙醇濃度的增加有顯著提高，隨后卻有所下降。桑黃酚類化合物多具有較多的酚羥基，具有一定的極性，根據(jù)相似相溶原理，只有當(dāng)提取溶劑的極性與多酚極性相似的時(shí)候，多酚才有最大的溶解度，提取效果最好，因此選取60%左右的乙醇濃度較佳。

2.3.2 超聲時(shí)間對(duì)多酚提取率的影響 固定料液比1∶20、超聲溫度50℃、乙醇濃度60%，分別超聲提取5、10、20、30、40min，考察不同超聲時(shí)間對(duì)桑黃多酚提取率的影響。結(jié)果，在20min時(shí)提取率達(dá)到最大值，再延長超聲時(shí)間，多酚得率趨于平穩(wěn)，有下降的趨勢(shì)。這可能是因?yàn)殡S時(shí)間延長，其他物質(zhì)也會(huì)溶出，限制多酚的提取，同時(shí)超聲強(qiáng)大的機(jī)械剪切作用會(huì)破壞多酚的結(jié)構(gòu)，因此選擇超聲時(shí)間在20min左右為宜。

2.3.3 超聲溫度對(duì)多酚提取率的影響 固定料液比1∶20、乙醇濃度60%、超聲時(shí)間20min，分別在20、30、40、50、60℃下超聲提取，考察不同溫度對(duì)桑黃多酚提取率的影響。結(jié)果，在20～50℃范圍內(nèi)，隨溫度提高多酚提取率提高，說明較高的溫度對(duì)多酚化合物的溶出是有利的。當(dāng)超過50℃后，多酚得率有所下降，這可能由于在較高溫度下，溶劑揮發(fā)嚴(yán)重加之其他物質(zhì)也隨之溶出的緣故。

2.3.4 料液比對(duì)多酚提取率的影響 固定乙醇濃度60%、超聲時(shí)間20min、超聲溫度50℃，按照1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30加入提取溶劑，考察不同料液比對(duì)桑黃多酚提取率的影響。結(jié)果，隨料液比的增加，多酚提取率相應(yīng)增加，這是由于溶劑用量增加，可以使藥材與溶劑接觸面積增大，并且能夠增大固液濃度差，有利于擴(kuò)散速度的提高。當(dāng)料液比＞1∶25后，多酚的提取率基本保持不變。

2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以乙醇濃度（A）、超聲時(shí)間（B）、超聲溫度（C）、料液比（D）為考察因素，以桑黃多酚提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按照L9（34）正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)。因素水平見表1；正交試驗(yàn)結(jié)果見表2；方差分析結(jié)果見表3。

表1 因素水平Tab 1 Levels and factors

由表2、表3可知，影響多酚提取率因素的主次順序?yàn)锽＞A＞C＞D，即在一定范圍內(nèi)，超聲時(shí)間對(duì)多酚提取得率影響最大，其次是乙醇濃度、超聲溫度，料液比影響最小。桑黃多酚超聲提取的最佳工藝條件為A2B3C2D2，即采用60%乙醇按照1∶25的料液比在50℃下超聲提取30min。

2.5 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Result of orthogonal test

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Analysis of variance

按照最佳試驗(yàn)條件重復(fù)試驗(yàn)3次，并計(jì)算桑黃多酚提取率。結(jié)果，其平均值為26.4mg·g-1，高于正交試驗(yàn)中各結(jié)果，說明所選工藝可行。

3 討論

將單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法有效結(jié)合對(duì)超聲輔助提取桑黃多酚的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳提取工藝條件：乙醇濃度60%，超聲提取溫度50℃，提取時(shí)間30min，料液比1∶25，在此條件下桑黃多酚得率為26.4mg·g-1，工藝切實(shí)可行?？傊?，超聲提取方法簡單，具有提取效率高、時(shí)間短、無需加熱等優(yōu)點(diǎn)，是一種較理想的提取桑黃多酚的方法。

[1] Balasundram N，Sundram K，Samman S.Phenolic compounds in plants and agri-industrialby-products：antioxidant activity，occurrence，and potential uses[J].Food Chem，2006，99（1）：191.

[2] 莫順燕，楊永春，石建功.桑黃化學(xué)成分研究[J].中國中藥雜志，2003，28（4）：339.

[3] Chen W，He FY，Li YQ.The apoptosis effect of hispolon from Phellinus igniarius（Berkeley&Curtis）Teng on human epidermoid KB cells[J].J Ethnopharmacol，2006，（105）：280.

[4] Yoon HR，Paik YS.Antioxidative and prolyl endopeptidase inhibitory activities of the phenolic constituents isolated from Phellinus igniarius[J].J App Biol Chem，2010，53（5）：652.

[5] Jing Wang，Baoguo Sun，Yanping Cao，et al.Optimisation of ultrasound-assisted extraction of phenolic compounds from wheaat bran[J].Food Chen，2008，106（2）：804.

Optimization of Ultrasound-assisted Extraction of Polyphenols from Phellinus igniarius by Orthogonal Test

FENG Zi-wang（School of Clinic Medicine，Jiangsu University，Jiangsu Zhenjiang 212013，China）
YU Li-chao，LI Feng（Affiliated Hospital of Jiangsu University，Jiangsu Zhenjiang 212001，China）
XU Xiu-quan（College of Pharmacy，Jiangsu University，Jiangsu Zhenjiang 212013，China）

OBJECTIVE：To optimize ultrasonic extraction technology of polyphenols from Phellinus igniarius.METHODS：The extraction process was optimized by single element test and orthogonal test with the extraction rate of polyphenols as the index using the ethanol concentration，extraction temperature，extraction time and liquid-material ratio as factors.RESULTS：The optimum extraction conditions were as follows：ethanol concentration 60%，extraction time 30min，extraction temperature 50℃ and liquid-material ratio of 1∶25.Under these conditions，the maximal yield of total polyphenols reached 26.4mg·g-1.CONCLUSION：Ultrasound extraction technology，spending less time and obtaining high yield，is an effective and rapid method for extracting polyphenols from P.igniarius.

Phellinus igniarius；Polyphenols；Orthogonal test；Ultrasonic extraction

R284.2；R283

A

1001-0408（2012）03-0221-02

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2012.03.10

Δ鎮(zhèn)江市科技計(jì)劃（社會(huì)科技支撐）項(xiàng)目（SH2010033）

＊碩士研究生。研究方向：心胸外科食管腫瘤的預(yù)防、治療。E-mail：fzw622@126.com

#通訊作者：講師，博士研究生。研究方向：天然活性成分提取分離及其活性。電話：0511-85038403。E-mail：xxq781026@sohu.com

2011-03-17

2011-06-15）