正交試驗(yàn)優(yōu)選杜仲多糖提取工藝Δ

史秀玲，高銀輝，梁海英，周程艷（.河北樂(lè)亭縣醫(yī)院，河北樂(lè)亭063600；.唐山市豐潤(rùn)區(qū)中醫(yī)院，河北唐山 064000；3.沈陽(yáng)藥科大學(xué)，沈陽(yáng) 006）

正交試驗(yàn)優(yōu)選杜仲多糖提取工藝Δ

史秀玲1＊，高銀輝1，梁海英2，周程艷3#（1.河北樂(lè)亭縣醫(yī)院，河北樂(lè)亭063600；2.唐山市豐潤(rùn)區(qū)中醫(yī)院，河北唐山 064000；3.沈陽(yáng)藥科大學(xué)，沈陽(yáng) 110016）

目的：優(yōu)選杜仲多糖的提取工藝。方法：用普通水提醇沉法和微波提取法分別提取杜仲多糖，以提取溫度、提取時(shí)間、料液比、提取次數(shù)為考察因素，以多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)選工藝。結(jié)果：普通水提醇沉法的最佳工藝為溫度120℃、時(shí)間2h、料液比1∶8、次數(shù)3次；微波提取法的最佳工藝為溫度50℃、時(shí)間45min、料液比1∶20、次數(shù)3次。結(jié)論：微波提取法對(duì)杜仲多糖的提取有輔助作用，較普通水提醇沉法更優(yōu)。

杜仲多糖；水提醇沉法；微波提取法；正交試驗(yàn)

杜仲Eucommia ulmoides Oliv.，古稱(chēng)“曼榆”，又名“木棉”，為杜仲科杜仲屬的落葉喬木，傳統(tǒng)上用皮入藥，為我國(guó)特有的單科目、單屬科、單種屬植物，已經(jīng)有2000多年的栽培歷史[1]。近些年的研究發(fā)現(xiàn)，杜仲的主要化學(xué)成分有木脂素、環(huán)烯醚萜類(lèi)、苯丙素類(lèi)、黃酮類(lèi)、三萜類(lèi)、多糖類(lèi)等，其中杜仲多糖是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的活性成分。但目前杜仲多糖的研究主要是含量測(cè)定和藥理作用，對(duì)其提取的研究較少而且提取效果不好。因此，筆者以杜仲莖皮的干燥粉末為原料，采用正交設(shè)計(jì)分別對(duì)普通水提醇現(xiàn)法和微波提取法的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以為杜仲多糖的進(jìn)一步研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

DHG-9101.2電熱恒溫鼓風(fēng)干熱箱（金壇市榮華儀器制造有限公司）；XH-100B微波化學(xué)合成儀/萃取儀（北京祥鵠科技發(fā)展有限公司）；TU-180紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；BT125D十萬(wàn)分之一電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；FA2104N萬(wàn)分之一電子天平、FA2104N普通電子天平（上海民橋精密儀器廠）；MAS-I微波萃取儀（上海新儀微波化學(xué)科技有限公司，功率：250W，頻率：40kHz）。

杜仲莖皮和葉，購(gòu)于唐山市藥材有限公司，經(jīng)河北聯(lián)合大學(xué)中藥學(xué)院中醫(yī)教研室包巨太教授鑒定為真品，藥材經(jīng)80℃干燥6h，粉碎后備用；苯酚、碳酸氫鈉、鋁片、葡萄糖、濃硫酸均為分析純。

2 方法

2.1 杜仲多糖的提取

稱(chēng)取杜仲樣品10g，干燥，粉碎至一定粒度，置于圓底燒瓶中，分別用水提醇沉和微波提取的方法提取。殘?jiān)匆欢弦罕?、提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)，采用水提或微波浸提一段時(shí)間，去上清液濃縮后以95%乙醇沉淀，離心取沉淀物，無(wú)水乙醇洗滌數(shù)次，干燥，即得杜仲粗多糖。按下式計(jì)算多糖提取率：多糖提取率（%）＝多糖重量/杜仲樣品重量×100%。

2.2 多糖含量測(cè)定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱(chēng)取105℃下干燥至恒重的葡萄糖100.6mg，置于100mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得1.006mg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密吸取此標(biāo)準(zhǔn)品溶液 0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0mL，分別置于25mL容量瓶中，加去離子水稀釋至刻度，搖勻。精密吸取上述各種溶液2.0mL，分別加入5%的苯酚溶液1.0mL，搖勻，迅速加入5.0mL濃硫酸，振搖5min，置于沸水浴中加熱15min，然后置于冷水浴中冷卻30min。以去離子水2mL按上述條件處理的溶液作為空白，參考文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[2，3]，選擇在481nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以葡萄糖檢測(cè)濃度（Y）為橫坐標(biāo)，吸光度（X）為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y＝14.285X－0.123（r＝0.9953，n＝12）。結(jié)果表明，葡萄糖檢測(cè)濃度在0.032～0.120mg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.2.2 供試品溶液的制備 取正交試驗(yàn)項(xiàng)下各樣品溶液適量，按“2.2.1”項(xiàng)下自“精密吸取此標(biāo)準(zhǔn)品溶液”起處理各樣品溶液，即得各供試品溶液。

2.2.3 精密度試驗(yàn) 精密量取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液2mL，按“2.2.1”項(xiàng)下方法重復(fù)測(cè)定6次。結(jié)果，RSD＝0.50%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取供試品溶液2mL，在0、30、60、90、120、150min時(shí)，按“2.2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定。結(jié)果，RSD＝0.06%（n＝6），表明供試品溶液在顯色操作完成后150min內(nèi)基本穩(wěn)定。選擇測(cè)定時(shí)間為反應(yīng)顯色后30min。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品溶液適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定。結(jié)果，RSD＝1.43%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.2.6 加樣回收率試驗(yàn) 取所提取的已知多糖含量的供試品溶液（含量：55.67%，取樣量：2mL）6份，分別置于試管中，加入1.006mg葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，平均回收率為102.5%，RSD＝0.86%（n＝6）[4，5]。

2.3 普通水提醇沉工藝的優(yōu)選

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）、料液比（C）、提取次數(shù)（D）為考察因素，根據(jù)L9（34）正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn)，并測(cè)定多糖含量，計(jì)算多糖提取率。以多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)優(yōu)選工藝。因素水平見(jiàn)表1；正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2；方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 因素水平Tab 1 Factors and levels

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Results of orthogonal experiment

由表2、表3可知，各因素對(duì)提取效果的影響主次順序?yàn)樘崛r(shí)間＞提取溫度＞料液比＞提取次數(shù)，且前3個(gè)因素對(duì)工藝均有顯著性影響（P＜0.05）。最佳提取工藝為A3B2C2D3，即溫度120℃、時(shí)間2h、料液比1∶8、提取3次。在此條件下，多糖提取率為22.54%。

2.4 微波提取工藝的優(yōu)選[6]

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）、料液比（C）、提取次數(shù)（D）為考察因素，根據(jù)L9（34）正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn)，測(cè)定多糖含量，并計(jì)算多糖提取率。以多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)優(yōu)選工藝。因素水平見(jiàn)表4；正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5；方差分析結(jié)果見(jiàn)表6。

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Results of variance analysis

表4 因素水平Tab 4 Factors and levels

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 5 Results of orthogonal experiment

表6 方差分析結(jié)果Tab 6 Results of variance analysis

由表5、表6可知，各因素對(duì)提取效果的影響主次順序?yàn)樘崛囟龋玖弦罕龋咎崛〈螖?shù)＞提取時(shí)間，且除提取時(shí)間外的其他因素對(duì)工藝均有顯著性影響（P＜0.05）。最佳提取工藝為A3B2C1D3，即溫度50℃、時(shí)間45min、料液比 1∶20、次數(shù)3次。在此條件下，多糖提取率為23.40%。

3 討論

在對(duì)普通水提和微波提取法進(jìn)行比較研究后發(fā)現(xiàn)，2種方法下杜仲多糖的提取率無(wú)太大差別，但微波提取法可節(jié)省50%～90%的時(shí)間；另外，微波提取法可有效保護(hù)食品、藥品以及其他化工物料中的功能成分，提取物質(zhì)量高；對(duì)萃取物具有高選擇性；耗能低。故微波提取法較優(yōu)[7，8]。

本試驗(yàn)表明，利用微波提取法提取杜仲多糖是可行的，各影響因素中，提取溫度影響最大，溫度低，多糖溶出速度慢；溫度高，多糖溶出速度快，同時(shí)蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的生成量也大大增加，為后續(xù)處理帶來(lái)不便，所以溫度在50℃較合適。其次是料液比，當(dāng)料液比為1∶20時(shí)提取效率較好，且節(jié)省溶劑。再次是提取次數(shù)，提取次數(shù)越多提取率越高，但考慮提高效率，一般提取3次。最后是提取時(shí)間，加熱45min比較合適，加熱時(shí)間短，多糖沒(méi)有完全溶出；加熱時(shí)間長(zhǎng)，多糖又被機(jī)械剪切成小分子而損失掉。綜上所述，微波提取法的最佳工藝條件為溫度50℃、時(shí)間45min、料液比1∶20、次數(shù)3次。

[1] 王景祥.杜仲葉和杜仲皮的成分比較[J].中草藥，1987，18（3）：11.

[2] 陳錦鵬，林曉翠，王碧玉，等.仙草多糖提取工藝研究[J].化學(xué)工程與裝備，2009，3（3）：1.

[3] 周程艷，馬紅翠，王 美，等.不同采收期杜仲葉和果實(shí)中總黃酮和多糖含量比較[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（11）：111.

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[5] 沈 蔚，任曉婷，張 建，等.蘆根多糖的提取及抗氧化活性的研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21（5）：1078.

[6] 杜敏華，田 龍.微波輔助法提取杏鮑菇多糖研究[J].食品科學(xué)，2007，3：117.

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Optimization of the Extraction Process for Eucommia ulmoides Polysaccharides by Orthogonal Test

SHI Xiu-ling，GAO Yin-hui（Leting County Hospital of Hebei Province，Hebei Leting 063600，China）
LIANG Hai-ying（Tangshan Fengrun District Hospital of TCM，Hebei Tongshan 064000，China）
ZHOU Cheng-yan（Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction process for Eucommia ulmoides polysaccharides（EOP）.METHODS：Aqueous extraction and microwave extraction were used for the extraction of E.ulmoides polysaccharides.The extraction technology of E.ulmoides polysaccharides was optimized by orthogonal test with extraction temperature，extraction time，solid-liquid rate and extraction times as factors using extraction rate as index.RESULTS：The optimum process conditions with aqueous extraction were as follows：extraction temperature of 120℃，extraction time of 2h，solid-liquid ratio of 1∶8，extracting for 3times.The optimum process conditions with microwave extraction were as follows：extraction temperature of 50℃，extraction time of 45min，solid-liquid ratio of 1∶20，extracting for 3times.CONCLUSION：Microwave-assisted extraction is helpful to extract E.ulmoides polysaccharides，and it is better than aqueous extraction.

Eucommia ulmoides polysaccharides；Aqueous extraction；Microwave extraction；Orthogonal test

R284.2；R283

A

1001-0408（2012）03-0223-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2012.03.11

Δ唐山市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展指導(dǎo)計(jì)劃項(xiàng)目（111302098a）

＊副主任中藥師。研究方向：中藥有效成分及中藥藥理。電話：0315-4620295。E-mail：sxlxyy@163.com

#通訊作者：副教授，博士研究生。研究方向：中藥藥效和有效成分篩選。E-mail：xuefanone@sohu.com

2011-09-15

2011-12-05）