情志應激誘發(fā)肝硬化大鼠模型肝臟病理學的研究*

雅森·米吉提，玉蘇甫·吐爾遜，熱孜萬古麗·艾合買提，

吾斯曼·艾海提4，米熱古麗·艾艾乃都2

(1．新疆醫(yī)科大學國際教育學院，新疆 烏魯木齊830011;2．新疆醫(yī)科大學維吾爾醫(yī)藥系，新疆 烏魯木齊830011;3．新疆醫(yī)科大學第六附屬醫(yī)院骨一科，新疆 烏魯木齊830002;4．新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院藥劑科，新疆 烏魯木齊830011)

肝硬化是各種慢性肝病的終末期病變，以肝結(jié)構(gòu)破壞－壞死，再纖維結(jié)締組織彌漫增生、進一步假小葉結(jié)構(gòu)形成為特點。我國的原發(fā)性肝癌絕大多數(shù)合并慢性酒精性肝炎及肝硬化，而80%的原發(fā)性肝癌合并肝硬化［1］。從肝臟疾病的病因研究來看，工作高度緊張、心理負擔重的人是肝臟疾病的特殊易感人群之一。從肝硬化的病因研究來看，社會心理因素越來越為人們重視，認為肝硬化是遺傳因素和環(huán)境因素交互作用的結(jié)果［2］，而這與中醫(yī)理論中的情志致病理論也吻合。因此，本研究用二乙基亞硝胺(DEN)溶液，同時施加實驗性應激(限制、不良精神刺激)，模擬制作情志不遂誘導肝硬化動物模型，探討慢性情志應激對肝硬化大鼠模型的病理影響。

1 材料與方法

1．1 動 物

Wistar 大鼠40 只，清潔級，雄性，體質(zhì)量(150±30)g ，由新疆醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號:SCXK(新)20032001。

1．2 主要試劑與儀器

DEN，為Sigma 公司產(chǎn)品。RQH－350 型人工氣候箱及JXDT－1 型小鼠跳臺儀器，均為上海精宏實驗設備有限公司產(chǎn)品;BS－1105 型電子天平，北京賽多科斯天平有限公司產(chǎn)品;JEM100CXⅡ透射電鏡，日本LEIKA 公司產(chǎn)品;DM2500 顯微成像系統(tǒng)及LEICARM 2235 手動輪轉(zhuǎn)式切片機，均為德國徠卡公司產(chǎn)品;BMJ-1 生物組織包埋機、TSJ-IA 自動組織脫水機及KZPJ-1A 生物組織攤烤片機，均為天津天利航空機電有限公司產(chǎn)品。

1．3 動物分組

將40 只大鼠穩(wěn)定飼養(yǎng)3 d 后，分為正常組、應激組、單純DEN 組和DEN+應激組，每組10 只。

1．4 肝硬化模型的建立

單純DEN 組和DEN+應激組按照文獻［3］，以食用水配制0．1 g/ L 的DEN 溶液，自由飲用，每天更換1 次，連續(xù)飲用15 周停藥，建立肝硬化大鼠模型。

1．5 慢性情志應激刺激

①制動。按照文獻［4］，將大鼠放入20 cm ×5 cm×5 cm 鐵筒中，水平置于實驗臺，保證大鼠不受壓。以不能回轉(zhuǎn)身為度，但其運動受限制，光線晦暗，每天45 min。②不良精神刺激。按照文獻［5］略加改進，采用間斷足底電刺激1 次/d，每次35 min、電壓40 V。

1．6 檢測指標

各組動物15 周后在麻醉狀態(tài)下頸椎脫臼處死所有動物。每組動物在同一部位取材，迅速取肝組織固定于100 g/L 的甲醛溶液中，經(jīng)5 d 固定后取材、石蠟包埋、切片、HE 染色，光學顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)單純DEN 組和DEN +應激組的大鼠肝組織病變類型均為肝硬化。

2 結(jié) 果

2．1 各組一般情況

由于足底電刺激和DEN 溶液的毒副作用，DEN+應激組1 只老鼠在第14 周死亡。單純DEN組和DEN+應激組肝硬化率為100%。

2．2 各組病理學觀察

正常對照組:肝小葉結(jié)構(gòu)完整清晰，肝細胞索排列整齊，圍繞小葉中央靜脈呈放射狀排列，細胞大小一致，肝血竇無狹窄，肝小葉及匯管區(qū)無炎性細胞浸潤，未見水腫或腫脹肝細胞，未見壞死肝細胞，未見纖維組織增生或纖維化。見圖1～2。應激組:肝小葉結(jié)構(gòu)完整清晰，門管區(qū)有少量炎細胞聚集，肝細胞輕微水腫并腫脹。見圖3～4。單純DEN 組:正常肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，形成大小不一的假小葉結(jié)構(gòu);纖維組織增生明顯;肝細胞水腫較重，還可見肝細胞腫脹。見圖5～6。DEN +應激組組:正常肝小葉結(jié)構(gòu)消失，可見形成大小不一肝細胞團，形成假小葉結(jié)構(gòu);纖維組織增生，纖維間隔變寬，其中見較多炎細胞浸潤;部分肝細胞水腫、變性、壞死，可見再生肝細胞。圖7～8。

3 討 論

肝硬化作為肝癌發(fā)生過程中的重要前期階段，對其研究可為肝癌的發(fā)病機制提供十分重要的實驗依據(jù)。建立實驗性動物模型為肝硬化的研究提供了全面、動態(tài)觀察癌變多階段演進過程的手段，是目前一種重要的研究方法［6］。近十幾年來，肝硬化的研究已成為世界醫(yī)學攻關(guān)的一個熱點課題，國內(nèi)外學者進行了大量相關(guān)動物實驗和臨床研究，取得了矚目的成就。動物模型建立為研究人類疾病的發(fā)病機制、預防和治療提供了的實驗依據(jù)。人們對肝硬化形成機制的了解，很大程度上取決于可靠的、可重復的動物模型。梁璇等［7］研究發(fā)現(xiàn):DEN 誘導大鼠肝硬化肝內(nèi)膠原沉積的變化，結(jié)果顯示隨著肝細胞變性、炎癥高峰到橋接性壞死、肝硬化形成。有的學者還建立過肝郁脾虛型肝硬化模型，發(fā)現(xiàn)肝郁脾虛型肝硬化模型比單純肝硬化模型組肝組織病理變化和生物表征更為明顯［8］。

隨著醫(yī)學領(lǐng)域?qū)π睦砩鐣蛩卦诟斡不l(fā)生中作用的重視，關(guān)于肝硬化病因?qū)W研究應該從包括情志在內(nèi)的多因素致病角度認識肝硬化的病因，即在強調(diào)生物因素致病作用時，不忽視心理因素在其發(fā)病中所起的作用，將兩者相互綜合，開展多學科研究以更利于肝硬化病因?qū)W的認識。病機是中醫(yī)對疾病的形成機制、動態(tài)變化和本質(zhì)要領(lǐng)的認識，是在分析和綜合疾病的各種表現(xiàn)之后獲得的。病機就是透過疾病的現(xiàn)象而對疾病本質(zhì)的一種規(guī)律性認識，是通過具體的病邪、病性、病位及病勢等病理要素不同組合體現(xiàn)出來的，因而病機具有整體性、動態(tài)性、本質(zhì)性的特點［9］。

本研究結(jié)果表明:低濃度DEN 溶液應用15 周可以建立穩(wěn)定肝硬化大鼠模型，并且DEN +應激組比單純DEN 組肝細胞出現(xiàn)的損傷壞死或異常增生，甚至細胞水腫程度、形成假小葉結(jié)構(gòu)等病理改變明顯或快。筆者推測:在肝硬化的發(fā)生過程中，DEN 溶液是其發(fā)生的主要原因，而慢性情志起到了促進作用。

總之，筆者采用了低劑量的DEN 溶液和多相應激刺激相結(jié)合的造模方式，從中醫(yī)病因?qū)W角度模擬情志不遂從而建立病(肝硬化)證(氣機紊亂)結(jié)合大鼠模型具有一定的可行性，其過程與人類肝硬化的發(fā)生過程極為相似，便于進行藥物干預和療效分析。

［1］謝勝學，許戈良．誘發(fā)性大鼠肝癌模型進展［J］．肝膽外科雜志，2007，15(3):237－239．

［2］Yoshiji H，Yoshii J，Ikenaka Y，et al．Inhibition of reninangiotensin system attenuates liver enzyme-altered preneoplastic lesions and fibrosis development in rats［J］．J Hepatol，2002，37(l):22－30．

［3］玉蘇甫·吐爾遜，哈木拉提·吾甫爾，斯坎德爾·白克力，等．二乙基亞硝胺誘發(fā)大鼠肝硬化模型的建立及病理學研究［J］．新疆醫(yī)科大學報，2011，34(3):261－264．

［4］李杰．情志應激誘發(fā)實驗2 型糖尿病病因?qū)W及相關(guān)機理的研究［D］．天津:天津中醫(yī)學院，2002:296－297．

［5］張有輝，哈木拉提·吾甫爾，玉蘇甫·吐爾遜，等．異常黑膽質(zhì)證載體大鼠模型的建立及其免疫、內(nèi)分泌紊亂狀態(tài)的研究［J］．新疆醫(yī)科大學學報，2010，33(6):596－600．

［6］Sell S，Dunsford HA．Evidence for the stem cell origin of hepatocellular carcinoma and cholangio carcinoma［J］．Am J Pathol，1989，134(6):1347－1363．

［7］梁璇，孫德國．肝復健沖劑對大鼠肝纖維化形成的影響［J］．中華中醫(yī)藥學刊，2011，29(6):1381－1382．

［8］夏小芳，徐珊．肝纖維化大鼠病證結(jié)合模型肝臟病理學觀察［J］．浙江中醫(yī)雜志，2010，45(2):101－102．

［9］成肇智，李咸榮．等．中醫(yī)病機論［M］．北京:中國醫(yī)藥科技出版社，1977:132－133．