NO/NOS 和T-AOC/LPO 在氣虛血瘀型萎縮性胃炎中的表達(dá)及益氣活血中藥干預(yù)作用的研究*

成映霞，段永強(qiáng)，楊曉軼，朱立鳴，張 虹

(1．甘肅中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)課部，甘肅 蘭州730020;2．甘肅省第二人民醫(yī)院，甘肅 蘭州730020)

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)的發(fā)生機(jī)制主要為多種因素誘發(fā)胃黏液、胃黏膜屏障防御減弱，胃動(dòng)力障礙，自由基交聯(lián)損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞的不典型性、異常分化和黏膜結(jié)構(gòu)紊亂。其中自由基在細(xì)胞內(nèi)大量堆積，損傷生物大分子，特別是通過脂質(zhì)過氧化損傷生物膜，使膜通透性增加，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙甚至細(xì)胞崩解。有研究［1］表明:自由基損傷在胃黏膜炎癥、萎縮病變中具有重要的誘導(dǎo)作用。益氣活血中藥治萎防變膠囊是基于臨床效方而研制的療效確切的醫(yī)院制劑之一，主治氣虛血瘀型CAG。本研究旨在通過實(shí)驗(yàn)研究治萎防變膠囊對(duì)CAG 大鼠胃黏膜一氧化氮(NO)/一氧化氮合酶(NOS)、總抗氧化能力(T-AOC )/過氧化脂質(zhì)(LPO)表達(dá)水平的影響，進(jìn)一步探討該制劑防治CAG 的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 動(dòng) 物

采用Wistar 大鼠90 只，SPF 級(jí)，體質(zhì)量(180 ±20)g，雌雄各半，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，均由甘肅中醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK (甘)2004－0006－0000202。

1．2 藥品、試劑與儀器

治萎防變膠囊由人參、枳實(shí)、白術(shù)、半夏、白花蛇舌草、三七等藥物組成，0．4 g / 粒，為甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，批號(hào)061208;維酶素，0．2 g / 片，山東魯北藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)060407;鹽酸雷尼替丁膠囊，江西匯仁藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)0611025?？捡R斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒(批號(hào)20071119，20051029 )、T-AOC 測(cè) 試 盒(批 號(hào)20071204)、LPO 測(cè)試盒(批號(hào)20071204)、NO 測(cè)試盒(批號(hào)20051122)、NOS 測(cè)試盒(批號(hào)20051120)，均由南京建成醫(yī)學(xué)生物研究所提供;甲基硝基亞硝基胍(MNNG)，F(xiàn)luka 公司產(chǎn)品，批號(hào)68051。DF 110 型電子分析天平，常熟市衡器廠產(chǎn)品;721 型可見光分光光度計(jì)，北京瑞利分析儀器公司產(chǎn)品;XYJ 80－2 離心機(jī)，江蘇響水縣醫(yī)療器械廠產(chǎn)品;HH－4數(shù)顯恒溫水浴箱，鄭州杜甫儀器廠產(chǎn)品。

1．3 分組、模型的建立與給藥

除空白對(duì)照組10 只大鼠正常飼養(yǎng)不予造模外，其余大鼠建立氣虛血瘀型CAG 模型，方法參照文獻(xiàn)［2－3］改進(jìn):①以滅菌水配制0．1 g/L 甲基硝基亞硝基胍溶液，給大鼠自由飲用(避光)，1 d 配制1 次。②采用饑飽失常喂養(yǎng)法:足量喂養(yǎng)2 d ，禁食1 d 。③給以鹽酸雷尼替丁膠囊0．03 g/kg 灌胃，1 d 1 次。綜合造模60 d 后，每隔1 周殺檢大鼠，取胃黏膜做病理檢查判定腸化生的情況，至第12 周，大鼠胃黏膜腸化生形成后開始治療。

造模成功后將CAG 大鼠按體質(zhì)量編號(hào)，用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型對(duì)照組，益氣活血中藥大、中、小劑量組，維酶素組，每組9 只，雌雄各半分籠飼養(yǎng)。益氣活血中藥大、中、小劑量組分別予0．6，0．3 ，0．15 g/(kg·d)益氣活血中藥灌胃(分別相當(dāng)于60 kg 成人每日劑量的10，5，2．5 倍)。維酶素組給予0．25 g/(kg·d)維酶素灌胃(相當(dāng)于60 kg 成人每日劑量的5 倍)，等效劑量按人與動(dòng)物體型系數(shù)折算［4］，給藥容積均為0．01 mL/g 體質(zhì)量。空白對(duì)照組、模型對(duì)照組給予同體積蒸餾水灌胃。各組均灌胃給藥90 d。

1．4 檢測(cè)指標(biāo)

各組動(dòng)物于末次灌胃給藥后，禁食不禁水24 h，測(cè)體質(zhì)量并記錄后，斷頭處死大鼠。胃黏膜組織勻漿制備:低溫條件下快速剖取胃黏膜組織，以冰冷的生理鹽水沖洗，濾紙吸干，稱質(zhì)量后用眼科小剪刀盡快剪碎，置于勻漿器中，用組織重9 倍生理鹽水勻漿(勻漿器的末端置于放冰塊的冷水中)，以3500 r/min離心10 min，取上清液置4 ℃冰箱保存，采用比色法檢測(cè)NO/NOS 及T-AOC/LPO。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13．0 統(tǒng)計(jì)分析軟件處理。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)()±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，組間樣本均數(shù)差異的比較選用F檢驗(yàn)，在F檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，進(jìn)一步用q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。以P＜0．05 為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 各組大鼠胃黏膜NO 和NOS 水平對(duì)比

與空白對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組大鼠胃黏膜組織NO 和NOS 水平升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01，P＜0．05)。與模型對(duì)照組對(duì)比，益氣活血中藥各劑量組胃黏膜組織NO/NOS 水平降低，其中大劑量組此兩指標(biāo)較之差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05);維酶素組NO 水平與模型對(duì)照組對(duì)比，差別亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。見表1。

表1 各組大鼠胃黏膜NO 和NOS 水平對(duì)比 ±s

表1 各組大鼠胃黏膜NO 和NOS 水平對(duì)比 ±s

注:與空白對(duì)照組對(duì)比，* P ＜0．05，＊＊ P ＜0．01;與模型對(duì)照組對(duì)比，# P ＜0．05。

組 別 動(dòng)物數(shù) 劑量/(g·kg －1) NO/(μmol·g prot －1) NOS/(U·mg prot －1)6．84 ±1．37 2．12 ±0．54模型對(duì)照組 9 — 8．78 ±1．65＊＊ 2．82 ±0．73*益氣活血中藥大劑量 9 0．60 7．19 ±1．21# 2．25 ±0．57#益氣活血中藥中劑量 9 0．30 7．89 ±1．59 2．36 ±0．65益氣活血中藥小劑量 9 0．15 8．19 ±1．78 2．41 ±0．50維酶素組 9 0．25 7．28 ±1．15#空白對(duì)照組 9 —2．40 ±0．51

2．2 各組大鼠胃黏膜T-AOC 和LPO 水平對(duì)比

與空白對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組大鼠胃組織TAOC 水平降低、LPO 水平升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01)。與模型對(duì)照組對(duì)比，益氣活血中藥各劑量組T-AOC 水平升高、LPO 水平降低，大、中劑量組較之差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05);維酶素組LPO 水平與模型對(duì)照組對(duì)比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。見表2。

表2 各組大鼠胃黏膜T-AOC 和LPO 水平的影響 ±s

表2 各組大鼠胃黏膜T-AOC 和LPO 水平的影響 ±s

注:與空白對(duì)照組對(duì)比，＊＊ P ＜0．01;與模型對(duì)照組對(duì)比，#P ＜0．05。

組 別 動(dòng)物數(shù) 劑量/(g·kg －1) T-AOC/(U·mg prot －1) LPO/(nmol·mg prot －1)6．20 ±0．89 8．51 ±1．80模型對(duì)照組 9 — 4．85 ±0．82＊＊ 11．71 ±2．62＊＊益氣活血中藥大劑量 9 0．60 6．10 ±0．95# 9．32 ±2．02#益氣活血中藥中劑量 9 0．30 6．06 ±1．21# 9．08 ±2．03#益氣活血中藥小劑量 9 0．15 5．98 ±1．08 9．71 ±2．89維酶素組 9 0．25 5．75 ±0．92 9．33 ±2．56空白對(duì)照組 9 —#

3 討 論

慢性萎縮性胃炎屬中醫(yī)學(xué)“痞滿”“胃脘痛”范疇，主要病理機(jī)制為氣血兩虛、瘀血內(nèi)停的虛實(shí)夾雜之證，其中血瘀是CAG 的主要病理基礎(chǔ)。因本病病程遷延，反復(fù)難愈，病變由氣入血，由經(jīng)入絡(luò)，又易導(dǎo)致因虛致瘀的病理改變，此與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)“胃黏膜血循環(huán)障礙”的認(rèn)識(shí)相一致［5］。益氣活血法為臨床常用防治CAG 的治則治法之一。

有研究［6］表明:氧自由基與急慢性胃黏膜損傷、慢性萎縮性胃炎和胃癌的形成有密切關(guān)系。在正常生理?xiàng)l件下，機(jī)體內(nèi)存在著自由基的清除系統(tǒng)，其中T-AOC 是機(jī)體內(nèi)抗氧化力量的總體體現(xiàn)，是機(jī)體對(duì)抗氧自由基損傷的主要體系，是可以反映機(jī)體對(duì)外來刺激代償能力及抗氧化能力的良好指標(biāo)［7］。筆者在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn):CAG 模型大鼠胃黏膜LPO 水平明顯升高，而T-AOC 水平明顯下降，尤其是局部胃黏膜自由基代謝異常時(shí)更明顯。此說明了自由基代謝異常在CAG 中起著重要作用。

NO 是一種神經(jīng)遞質(zhì)和信使分子，由NOS 催化底物左旋精氨酸產(chǎn)生。NOS 主要有兩種異構(gòu)體，即原生型(CNOS)和誘生型NOS(iNOS)。其中iNOS 幾乎分布于所有組織中，在受到內(nèi)毒素或各種細(xì)胞因子刺激后被激活，可生成大量NO。NO 的作用因劑量、作用時(shí)間的不同而有很大差異，如:早期、小劑量NO 可以抑制內(nèi)皮素產(chǎn)生，增加胃黏膜血流量，具有細(xì)胞保護(hù)作用。當(dāng)iNOS 被激活釋放大量NO 時(shí)，過量生成的NO 一方面將發(fā)揮其自由基(或繼發(fā)生成的高活性羥自由基)性質(zhì)的細(xì)胞毒作用，直接損害胃黏膜血管內(nèi)皮細(xì)胞，刺激NO 更多釋放，形成惡性循環(huán);另一方面失去對(duì)ET 的抑制，減少胃黏膜血流量，造成胃黏膜缺血－再灌流損傷。同時(shí)，NO 是抑制性非腎上腺非膽堿能神經(jīng)的轉(zhuǎn)遞和調(diào)節(jié)遞質(zhì)。NO 的釋放可以延長(zhǎng)消化間期移動(dòng)性復(fù)合運(yùn)動(dòng)波相時(shí)間，引起胃排空延長(zhǎng)［8－9］，從而誘發(fā)胃動(dòng)力障礙。益氣活血中藥治萎防變膠囊主要由人參、枳實(shí)、白術(shù)、半夏、白花蛇舌草、三七等藥味經(jīng)過提取、分離而組成，主治氣虛血瘀型慢性萎縮性胃炎。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明:人參［10］、枳實(shí)［11］、白術(shù)［12］、半夏［13］、白花蛇舌草［14］、三七［15］所含有效成分具有不同程度改善胃腸平滑肌運(yùn)動(dòng)、解痙鎮(zhèn)痛、抗自由基損傷、抑制血小板聚集、抑殺幽門螺桿菌，以及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抗腫瘤的作用。本研究結(jié)果顯示:益氣活血中藥治萎防變膠囊可通過提高胃黏膜組織抗氧化能力、減輕自由基膠聯(lián)損傷來發(fā)揮保護(hù)胃黏膜的作用。

［1］Sakai H，Ohira Y，Tanaka A，et al．Inhibition of small-conductance Cl-channels by the interleukin-1 beta-stimulated production of superoxide in rabbit gastric parietal cells［J］．J Physiol，2003，551(Pt1):207－217．

［2］陸為民，單兆偉，吳靜，等．大鼠慢性萎縮性胃炎癌前病變氣虛血瘀證動(dòng)物模型的研制［J］．南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2000，16(3):156－158．

［3］岳雙冰，張仲海，馬經(jīng)野，等．大鼠慢性萎縮性胃炎癌前病變血瘀積證模型的研制［J］．中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2009，17(2):123－125．

［4］陳奇．中藥藥理研究方法學(xué)［M］．北京:人民衛(wèi)生出版社，1993:33－34．

［5］張彩，丁濤，李赫楠，等．解毒活血方對(duì)實(shí)驗(yàn)性萎縮性胃炎大鼠血漿ET-1 的影響［J］．河北中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2008，23(3):9－10．

［6］Villegas I，Martin AR，Toma W，et al．Rosiglitazone，an agonist of peroxisome proliferator-activated receptor gamma，protects against gastric ischemia-reperfusion damage in rats:role of oxygen free radicals generation［J］．Eur J Pharmacol，2004，505(1/3):195－203．

［7］蔣蕊，杜永成，張新日，等．雷公藤多苷對(duì)哮喘大鼠血清及肺組織NO 含量和總抗氧化能力的影響［J］．山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，39(4):311．

［8］吳云林．消化病與內(nèi)鏡［M］．上海:上海科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，1998:89－95，144－152．

［9］吳建維，羅金燕，龔均，等．一氧化氮對(duì)小腸消化間期移行性復(fù)合運(yùn)動(dòng)作用的研究［J］．中華消化雜志，1999，19(2):82．

［10］黎陽，張鐵軍，劉素香．人參化學(xué)成分和藥理研究進(jìn)展［J］．中草藥，2009，40(1):164－165．

［11］朱玲，楊峰．枳實(shí)的藥理研究進(jìn)展［J］．中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2004，32(2):64－66．

［12］宿廷敏，王敏娟，阮時(shí)寶．白術(shù)的化學(xué)成分及藥理作用研究概述［J］．貴陽學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2008，3(2):32－34．

［13］李麗，王慧娟，蓋成萬．半夏的藥理和臨床研究進(jìn)展［J］．中醫(yī)藥信息，2006，23(5):38－39．

［14］黃建榮，劉詠海，喻志標(biāo)．白花蛇舌草化學(xué)成分和藥理活性研究進(jìn)展［J］．中成藥，2005，27(11):1329－1331．

［15］馮陸冰，潘西芬，孫澤玲．三七的藥理作用研究進(jìn)展［J］．中國(guó)藥師，2008，11(10):1185－1186．