采用原子力顯微鏡分析乳酸鏈球菌素結(jié)構(gòu)的研究

杜 琨，陳錦屏，蘇鳳賢

（1.陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062；2.武警工程學(xué)院軍事經(jīng)濟(jì)系，陜西西安710086；3.河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅張掖734000）

采用原子力顯微鏡分析乳酸鏈球菌素結(jié)構(gòu)的研究

杜 琨1，2，陳錦屏1，蘇鳳賢3

（1.陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062；2.武警工程學(xué)院軍事經(jīng)濟(jì)系，陜西西安710086；3.河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅張掖734000）

目的：采用原子力顯微鏡對乳酸鏈球菌素的分子形貌進(jìn)行觀測，為研究其抑菌機(jī)理提供有力的科學(xué)依據(jù)和可靠、直觀的實(shí)驗(yàn)方法。方法：從川西高原牧民自然發(fā)酵酸奶中分離篩選乳酸鏈球菌素產(chǎn)生菌，利用其發(fā)酵獲得產(chǎn)乳酸鏈球菌素效價(jià)高的產(chǎn)生菌C201，用原子力顯微鏡觀察其分子形貌。結(jié)果：乳酸鏈球菌素分子在溶液中呈樹狀的不規(guī)則“峰”狀聚集體，帶有很多側(cè)鏈分支，并且肽鍵之間形成穩(wěn)定的螺旋結(jié)構(gòu)。結(jié)論：原子力顯微鏡能直觀地表征乳酸鏈球菌素的分子結(jié)構(gòu)，是對研究乳酸鏈球菌素的抑菌機(jī)理在形態(tài)學(xué)上的完善。

原子力顯微鏡，乳酸鏈球菌素，提取分離

原子力顯微鏡（atomic force microscopy，AFM）是在Binning[1]等人發(fā)明的掃描隧道顯微鏡（STM）基礎(chǔ)上發(fā)展而成，其目的是為了使非導(dǎo)體也能夠采用掃描探針顯微鏡（SPM）進(jìn)行觀察。與其他電子顯微鏡相比，AFM的納米量級的高空間分辨率尤為突出（縱向分辨率：0.1nm）。它被廣泛地用于不同聚合物鏈包括DNA[2-3]、蛋白質(zhì)[4]、小核菌多糖[5]等多種大分子鏈構(gòu)象的分析研究中。乳酸鏈球菌素（Nisin）是由某些乳酸乳球菌產(chǎn)生的一種低分子量細(xì)菌素，能抑制大部分革蘭氏陽性菌及其芽孢的生長和繁殖，對金黃色葡萄球菌、溶血鏈球菌作用明顯，而對人體無毒，其毒理和生物學(xué)研究表明，它是一種安全的天然防腐劑。文獻(xiàn)報(bào)道，乳酸鏈球菌素是一種新型低聚肽，可以被人體內(nèi)酶降解、消化，不會(huì)產(chǎn)生抗性和過敏反應(yīng)；對食品的色、香、味、口感不產(chǎn)生副作用；可降低殺菌溫度，減少熱處理時(shí)間，因此可保持食品的營養(yǎng)價(jià)值、風(fēng)味、結(jié)構(gòu)、顏色等[6]。但目前國內(nèi)外對其分子構(gòu)象的報(bào)道相對較少，尚無用原子力顯微鏡對其分子形貌進(jìn)行直接觀測的報(bào)道。本研究采用原子力顯微鏡觀察從高原自然發(fā)酵酸奶中分離、提取、經(jīng)純化后得到的乳酸鏈球菌素表面形貌，為進(jìn)一步研究其高級結(jié)構(gòu)和構(gòu)效關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸奶 采集于四川西部地區(qū)；乳酸鏈球菌素 為本實(shí)驗(yàn)室從酸奶中分離、提取、純化；SephadexG-25 由Phamacia公司提供；其余藥品 均為分析純。

SPM-9500J3型原子力顯微鏡 日本島津公司；TU-1800型紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；磁力攪拌器，RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，冷凍干燥機(jī)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的定向分離 本實(shí)驗(yàn)8個(gè)菌株分離自川西高原自然發(fā)酵酸奶，菌株編號及采樣地情況見表1。酸奶樣品用無菌玻棒充分?jǐn)噭?，用無菌注射器吸取樣品于無菌采樣瓶中，置于冰盒內(nèi)，另用玻棒蘸取少許樣品，用精密pH試紙測試pH。所采樣品帶回實(shí)驗(yàn)室，分裝于無菌試管中，放入4℃冰箱保存?zhèn)溆?，剩余樣?70℃保存。

表1 酸奶采集地Table 1 The yoghurt gathering places

分別取從不同采樣地采集的酸奶，按1%接種量加入到含乳酸鏈球菌素和溴甲酚紫的M17G液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24h，把M17G液體培養(yǎng)物制成10-4、10-5、10-6稀釋度的菌懸液，分別吸取0.1mL放入M17固體分離培養(yǎng)基上，涂布，28℃培養(yǎng)24h，挑選單菌落，在分離培養(yǎng)基上劃線，反復(fù)3次。

1.2.2 菌株的篩選

1.2.2.1 指示菌懸液的制備 將金黃色葡萄球菌從斜面培養(yǎng)基上刮下，于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，取生長量為107cfu/mL的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液作為指示菌懸液。

1.2.2.2 發(fā)酵樣效價(jià)測定 取1g發(fā)酵培養(yǎng)液加入到9mL 0.02mol/L鹽酸稀溶液中，或用0.02mol/L的稀鹽酸將發(fā)酵液適當(dāng)稀釋（稀釋到其抑菌圈直徑在5～100IU/mL的乳鏈菌肽標(biāo)準(zhǔn)液的抑菌圈直徑之間），再用沸水浴加熱5min后，于5000r/min離心10min，取上清液，用瓊脂擴(kuò)散法測定其生物效價(jià)。

1.2.3 SephadexG-25凝膠柱層析 將C201在SephadexG-25凝膠柱上用0.02mol/L HCl進(jìn)行洗脫，流速0.5mL/min，洗脫液經(jīng)280nm處紫外檢測，收集洗脫峰，用紙片法測定各洗脫峰的抑菌活性。

1.2.4 AFM制樣 用雙蒸水溶解已制備好的乳酸鏈球菌素。磁力攪拌器持續(xù)攪拌1h，配成1μg/mL溶液。室溫保持1h，進(jìn)一步使樣品溶解完全且減少大聚集體的存在。取1μg/mL的溶液5μL，滴在新剝離的云母表面上，室溫空氣中干燥后，原子力顯微鏡觀測[7]（氯化鉀溶液稀釋的樣品滴在云母上干燥后雙蒸水沖洗，無水醇固定，室溫空氣中干燥，原子力顯微鏡觀測）。

1.2.5 原子力顯微鏡觀測 采用日本島津公司的SPM 9500J3型原子力顯微鏡，室溫下大氣環(huán)境中對乳酸鏈球菌素的分子形態(tài)進(jìn)行掃描觀測。圖像均在Tapping模式下獲得，探針為Si3N4（微懸臂長：200μm，彈性系數(shù)0.12N/m），原子力顯微鏡圖像的形態(tài)學(xué)特征（如高度、寬度等）均采用原子力顯微鏡附帶的軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離

根據(jù)報(bào)道發(fā)現(xiàn)，編碼乳鏈菌肽前體的基因（nip+）與乳鏈菌肽抗性基因（nis+）和蔗糖發(fā)酵基因（suc+）緊密連鎖[8]，據(jù)此，采用定向分離乳鏈菌肽產(chǎn)生菌的方法：即在蔗糖作碳源和添加適當(dāng)乳鏈菌肽的改良M17培養(yǎng)基上，配以溴甲酚紫作指示劑，如果一個(gè)菌株既對乳鏈菌肽具有抗性，又能利用蔗糖，則能使菌落周圍的培養(yǎng)基由紫色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，很容易用肉眼加以識別。然后檢測該菌株是否產(chǎn)生抑菌物質(zhì)。分離到17株使培養(yǎng)基變黃的菌株，結(jié)果見表2。

表2 初篩使分離培養(yǎng)基變黃的菌株Table 2 The strains which made separation medium yellow after preliminary screening

2.2 效價(jià)測定

把分離得到的17個(gè)菌株24h發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵液離心取上清液，用牛津杯定量擴(kuò)散法進(jìn)行抑菌活性的測定，培養(yǎng)基利用改良的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，消除了酸的作用，避免了假抑菌現(xiàn)象的出現(xiàn)[9-10]。初篩后搖瓶發(fā)酵測其效價(jià)，結(jié)果見表3。從表中可以看出，C201效價(jià)較高，超過800IU/mL。

表3 菌株發(fā)酵產(chǎn)物效價(jià)測定Table 3 Determination of strains fermentation potency

2.3 SephadexG-25凝膠柱層析

以金黃色葡萄球菌為指示菌，分別對第6管和第11管進(jìn)行抑菌活性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示只有第二個(gè)洗脫峰（即第11管）具有抑菌活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1和圖2。對其洗脫液冷凍干燥，供原子力顯微鏡觀察分析使用。

圖1 SephadexG-25凝膠柱層析圖Fig.1 SephadexG-25 gel column chromatography

圖2 第6管和第11管的抑菌活性圖Fig.2 The sixth and eleventh tubes antibacterial activity diagram

2.4 原子力顯微鏡觀察分析

乳酸鏈球菌素鏈的密度依賴于其初始濃度及其沉積到云母表面的量，圖像的對比度依賴于針尖上的作用力，作用力太大易損壞糖鏈，而太小則對比度差，最佳的作用力大致在3～4nN量級以內(nèi)，在掃描時(shí)不同的部位與分子鏈作用，會(huì)導(dǎo)致一定的增寬效應(yīng)。

圖3 乳酸鏈球菌素的AFM圖像Fig.3 The AFM image of Nisin

圖3中，在8.44×8.44μm的觀測范圍內(nèi)乳酸鏈球菌素的分子圖像清晰、穩(wěn)定。乳酸鏈球菌素的分子呈現(xiàn)大小不一的螺旋纏繞狀，支鏈直徑在5.31～20.88nm之間，鍵高為67.33～78.30nm之間。三維形貌圖下可以看到乳酸鏈球菌素不規(guī)則環(huán)上具有眾多明顯的“峰”狀突起，推測乳酸鏈球菌素分子鏈可能具有較多分支。分析認(rèn)為，乳酸鏈球菌素可能通過肽鍵先形成雙螺旋，后纏繞形成較大的聚集體。

3 結(jié)論

乳酸鏈球菌素的立體結(jié)構(gòu)是其生物活性的決定因素之一，研究低聚肽鏈的構(gòu)象以及低聚肽和綴合物間的空間關(guān)系對進(jìn)一步了解乳酸鏈球菌素的功能具有重要意義。本研究從川西高原牧民自然發(fā)酵酸奶中分離篩選得到17株乳酸鏈球菌素產(chǎn)生菌，利用其進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，獲得產(chǎn)乳酸鏈球菌素效價(jià)高的產(chǎn)生菌C201，采用原子力顯微鏡觀察其分子形貌。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳酸鏈球菌素的分子呈現(xiàn)大小不一的螺旋纏繞狀，支鏈直徑在5.31～20.88nm之間，鍵高為67.33～78.30nm之間。三維形貌圖下可以看到乳酸鏈球菌素不規(guī)則環(huán)上具有眾多明顯的“峰”狀突起，推測乳酸鏈球菌素分子鏈可能具有較多分支。由此可知，原子力顯微鏡能直觀地表征乳酸鏈球菌素的分子結(jié)構(gòu)，是對研究乳酸鏈球菌素的抑菌機(jī)理在形態(tài)學(xué)上的完善。采用原子力顯微鏡對乳酸鏈球菌素的分子形貌進(jìn)行觀測，為研究其抑菌機(jī)理提供了有力的科學(xué)依據(jù)和可靠、直觀的實(shí)驗(yàn)方法。

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Study on structure of Nisin using atomic force microscope analysis

DU Kun1，2，CHEN Jin-ping1，SU Feng-xian3
（1.College of Food Engineering and Nutritional Science，Shaanxi Normal University，Xi'an 710062，China；2.Department of Military Economics，Engineering College of Chinese Armed Police Force，Xi'an 710086，China；3.College of Agriculture and Biotechnology，Hexi University，Zhangye 734000，China）

Objective：The molecules morphology of Nisin were observed using AFM，and it can provide the scientific basis and reliable，intuitive experimental methods for antibacterial mechanism of Nisin.Method：The Nisin producing strains were isolated from natural fermented yogurt of the herdsman of western Sichuan plateau by purification.A high titer Nisin producing strain C201 was obtained by applied these strains to ferment，and observed its molecular morphology using atomic force microscope analysis.Results：The molecules of Nisin could aggregate to form micelles with dendritic irregular peak shapes in solution in the form of large numbers of side chain branching，and the peptide bond that form between the base pairs along a DNA or RNA molecule stabilized the helical structure.Conclusion：The molecular structure of Nisin could characterized directly by atomic force microscopy，so it is a new and scientific analytical method to study the antibacterial mechanism of Nisin in the morphological.

atomic force microscopy；Nisin；extraction

TS201.3

A

1002-0306（2012）05-0156-03

2011－05－12

杜琨（1975-），男，博士研究生，副教授，研究方向：動(dòng)物資源利用及功能食品研究。