高糖環(huán)境下大鼠DRG神經(jīng)元中PKCε和TRPV4mRNA的表達(dá)

那存烏力吉，丁炎，張銀雪，王明明，陳磊

（中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，沈陽 1 1 0 0 0 1）

痛性糖尿病神經(jīng)病變（painful diabetic neuropathy，PDN）是糖尿病患者慢性疼痛綜合征常見原因之一［1］，其中3%~20%的糖尿病患者并發(fā)PDN后導(dǎo)致痛覺過敏和異常疼痛。其分子機(jī)制目前還不甚清楚。背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）是機(jī)體內(nèi)外環(huán)境與脊髓連接的紐帶，是初級(jí)感覺傳入的第一級(jí)神經(jīng)元，DRG神經(jīng)元中存在許多與疼痛相關(guān)的受體、離子通道以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。瞬時(shí)感受器電位離子通道香草素受體4（transient receptor potential vanilloid 4，TRPV4）是 DRG 上的一種多覺感受器［2］，可感受低滲膨脹、機(jī)械刺激、溫度（>27℃）、佛波醇酯衍生物、花生四烯酸的代謝產(chǎn)物等理化刺激；也是一種非選擇性陽離子通道［3］，參與炎性痛、機(jī)械性疼痛等傷害性感覺的發(fā)生發(fā)展。持續(xù)機(jī)械壓迫明顯增加TRPV4基因和蛋白的表達(dá)［4］。TRPV4在神經(jīng)痛、囊性纖維化、癌癥等不同病理生理?xiàng)l件發(fā)生發(fā)展中越來越受到重視［5］。在一些敏感性神經(jīng)元中，蛋白激酶 Cε（protein kinase C ε，PKCε）也參與多種類型疼痛有關(guān)傷害性感受器的調(diào)節(jié)。PKCε的激活能夠誘導(dǎo)機(jī)械痛覺過敏，它是一個(gè)已修飾的疼痛前信號(hào)分子［6］。此外，在細(xì)胞試驗(yàn)中已證實(shí)，TRPV4與微管蛋白﹑肌動(dòng)蛋白﹑神經(jīng)纖維蛋白﹑PKCε以及鈣離子依賴性蛋白激酶2在DRG神經(jīng)元中相互影響［7］。

本實(shí)驗(yàn)擬通過觀察TRPV4和PKCεmRNA在高糖環(huán)境下培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元內(nèi)的表達(dá)，明確高糖環(huán)境對(duì)TRPV4和PKCε的影響，進(jìn)一步探討PDN的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

出生1~3 d的SPF級(jí)SD大鼠24只（由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），雌雄不拘，每只體質(zhì)量5~6 g。DRG細(xì)胞用DMEM/F12培養(yǎng)基（糖濃度為17.5 mmol/L）培養(yǎng)48 h后更換培養(yǎng)液并分組。根據(jù)培養(yǎng)液中糖濃度的不同，細(xì)胞分為3組：正常對(duì)照組（糖濃度為5.5 mmol/L，C組）、高糖1組（糖濃度為17.5 mmol/L，H1組）、高糖2組（糖濃度為35.0 mmol/L，H2組）。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM/F12（上海拜力生物科技有限公司）；RT-qPCR試劑盒、RNA提取試劑盒（日本TaKaRa公司）；L-多聚賴氨酸、DEPC-H2O、胰蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（鼎國昌盛生物公司）；PCR試劑盒（天根生化公司）；引物序列合成由TaKaRa公司完成。

1.3 DRG細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

取新生SD大鼠，用75%乙醇常規(guī)消毒，麻醉并處死后在超凈臺(tái)內(nèi)分離椎管，剪開，暴漏脊髓并將其去除干凈，用顯微鑷摘除L4~L6段脊髓DRG，置于裝有4℃D-Hanks的玻璃皿中。取材完畢神經(jīng)節(jié)放入0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化10 min，離心棄去胰酶，再將細(xì)胞接種至事先經(jīng)L-多聚賴氨酸處理的培養(yǎng)皿中，加入DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后更換培養(yǎng)液。換液后48 h提取細(xì)胞總RNA。

1.4 RT-PCR和real-time PCR檢測(cè)TRPV4和PKCε mRNA的表達(dá)

提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，以β-actin為內(nèi)參照。定性PCR用引物序列：TRPV4上游：5′-AAGTGGCGTAAGTTCGGG-3′，下游：5′-TAAGGGTA GGGTGGCGTG-3′，擴(kuò)增片段長度為122 bp。PKCε上游：5′-CGAGGACGACTTGTTTGAATCC-3′，下游：5′-CAGTTTCTCAGGGCATCAGGTC-3′，擴(kuò)增片段長度為 389 bp。β-actin 上游：5′-AGACCTTCAACACC CCAG-3′，下游：5′-CACGATTTCCCTCTCAGC-3′，擴(kuò)增片段長度為254 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)3%的瓊脂糖凝膠電泳并半定量分析。實(shí)時(shí)定量PCR用引物序列：TRPV4 上游：5′-ACCACGGTGGACTACCTGAG-3′，下游：5′-AGCCATCGACGAAGAGAGAA-3′，擴(kuò)增片段長度為 133 bp。PKCε上游：5′-CCCCTTGTGACCA GGAACTA-3′，下游：5′-AGCTGGCCATCAGTAGACG A-3′，擴(kuò)增片段長度為 109 bp。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)均用x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DRG神經(jīng)元分離及原代培養(yǎng)

神經(jīng)元突起生長明顯，多數(shù)比胞體直徑大，細(xì)胞之間形成網(wǎng)絡(luò)，胞體多為圓形、橢圓形，胞體邊緣較亮，折光性強(qiáng)。高糖中神經(jīng)元的貼壁生長及數(shù)量未發(fā)生明顯變化（圖1）。

2.2 高糖環(huán)境下大鼠DRG神經(jīng)元中PKCε、TRPV4 mRNA的表達(dá)

結(jié)果顯示，PKCεmRNA的表達(dá)與C組比較，H2組表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），而H1組表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。TRPV4表達(dá)結(jié)果顯示，與C組比較，H1組表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），而H2組表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見表1，圖2。

表1 各組大鼠D R G神經(jīng)元中P K C ε、T R P V 4mR N A的表達(dá)（n，x±s）T a b.1P K C εa n dT R P V 4mR N Ae x p r e s s i o n s i n D R Gn e u r o n s i n r a t s（n，x±s）

3 討論

糖尿病神經(jīng)病變與高血糖和胰島素相關(guān)信號(hào)的丟失有關(guān)，其中高血糖是主要的致病因素。二酰基甘油（diacylgycerol，DAG）在細(xì)胞內(nèi)的重要生理功能是激活PKC，高糖引起的DAG由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移，提高PKC與Ca2+、磷脂的親和力，胞液內(nèi)Ca2+在生理濃度下PKC即可被激活［8］。PKCε是屬于新型PKC同功酶類，在慢性疼痛的研究中，持續(xù)長時(shí)間的傷害性刺激容易導(dǎo)致組織損傷及外周炎癥，炎癥可以直接激活PKCε亞基，后者可以與編碼N型鈣通道的C端結(jié)合，從而使通道的開放增加［9］。TRPV4通道蛋白對(duì)機(jī)械刺激和低滲刺激的痛敏反應(yīng)主要與細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）和PKCε 2條信號(hào)傳導(dǎo)通路有關(guān)［10］。在特定的細(xì)胞信號(hào)通路引起的紫彬醇誘導(dǎo)的神經(jīng)痛研究中顯示，PAR2以及下游的磷酸酶C、PKCε和PKA的激活，會(huì)進(jìn)一步引起TRPV1、TRPV4以及TRPA1的敏化［11］。因此我們選擇疼痛傳導(dǎo)密切相關(guān)的DRG神經(jīng)元在體外模擬糖尿病高糖環(huán)境，研究高糖對(duì)DRG細(xì)胞內(nèi)PKCεmRNA、TRPV4mRNA表達(dá)的影響。

本研究結(jié)果顯示，高糖培養(yǎng)48 h后的TRPV4、PKCεmRNA表達(dá)水平與正常組比較明顯上調(diào)，然而TRPV4mRNA的表達(dá)水平?jīng)]有因糖濃度的升高而表達(dá)增強(qiáng)，而是在隨著糖濃度的升高先被誘導(dǎo)后被抑制，表現(xiàn)為H1組的表達(dá)高于H2組；與正常組比較，H1組表達(dá)上調(diào)。TRPV4是DRG上的一種多覺感受器［2］，參與機(jī)械性疼痛［4］、神經(jīng)痛［12］的痛覺傳導(dǎo)。高滲透壓（葡萄糖濃度40%）時(shí)可以有效阻滯蟾蜍坐骨神經(jīng)干神經(jīng)興奮的傳導(dǎo)［13］。因此，我們認(rèn)為H1組中TRPV4mRNA的表達(dá)上調(diào)可能是PKCε以及滲透壓共同作用的結(jié)果，而在H2組中TRPV4 mRNA表達(dá)抑制可能是高滲透壓的主導(dǎo)作用。

綜上所述，高糖環(huán)境可以上調(diào)DRG神經(jīng)元中TRPV4和PKCεmRNA的表達(dá)，但是其上調(diào)時(shí)糖濃度水平不一致，說明TRPV4的激活除了受PKCε的調(diào)控外還受其它因素調(diào)節(jié)。

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