陽離子卟啉對(duì)宮頸癌細(xì)胞株Caski的光動(dòng)力學(xué)殺傷效應(yīng)

呂昌帥，丁佰娟，劉洪麗，姜侃，張友忠

（山東大學(xué)齊魯醫(yī)院婦產(chǎn)科，濟(jì)南 2 5 0 0 1 2）

陽離子卟啉（TMPyP4），即四-（N-甲基-4-吡啶基）卟啉，是一類卟啉類衍生物，能夠選擇性地在腫瘤組織中聚集，在正常組織中卻代謝很快，因此長(zhǎng)期以來在腫瘤治療、尤其是光動(dòng)力學(xué)治療（photodynamic therapy，PDT）方面?zhèn)涫苋藗兊年P(guān)注。已有文獻(xiàn)報(bào)道，TMPyP4可展開RNA的G-四倍體結(jié)構(gòu)的極端穩(wěn)定性，并通過中斷G-四倍體鏈調(diào)節(jié)基因的活性［1］。PDT是一種新興腫瘤治療方法，其利用腫瘤細(xì)胞對(duì)光敏劑的特異性吸收和潴留，結(jié)合特定波長(zhǎng)的激光照射，達(dá)到選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。Ki-67是目前公認(rèn)的評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)的指標(biāo)。微型染色體維持蛋白（minichromosome maintenance proteins，MCMs）是一組蛋白家族，目前研究已證實(shí)其可作為增殖細(xì)胞的特異標(biāo)記［2］。碳酸酐酶Ⅸ（carbonic anhydraseⅨ，CA-Ⅸ）是碳酸酐酶家族異構(gòu)體之一，參與細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)化［3］。核因子kappa B（nuclear factor kappa B，NF-κB）是一種具有多向性調(diào)節(jié)作用的核轉(zhuǎn)錄因子，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移、抗凋亡及耐藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)［4，5］。多腫瘤抑制基因P16是一種細(xì)胞周期調(diào)控因子，負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及分裂［6，7］。目前關(guān)于 TMPyP4-PDT作用于宮頸癌細(xì)胞株的臨床研究較少，本研究通過觀察TMPyP4-PDT對(duì)宮頸癌Caski細(xì)胞株細(xì)胞凋亡的效應(yīng)，探討TMPyP4-PDT對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用及其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

TMPyP4，購自德國(guó)Merck公司；RPIM 1640培養(yǎng)基，購自美國(guó)GIBCO BRL公司；胎牛血清，購自杭州四季青公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT），購自Sigma公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，購自上海貝博生物公司；Trizol試劑，購自Invitrogen公司；RNase、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR擴(kuò)增試劑盒，均為東洋紡（上海）生物科技有限公司產(chǎn)品；實(shí)時(shí)熒光定量PCR所需引物，由上海博尚公司設(shè)計(jì)并合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：宮頸癌細(xì)胞株Caski培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPIM 1640培養(yǎng)液中，在5%CO2濃度、飽和濕度、37℃孵育箱中培養(yǎng)，3~4 d傳代1次，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組：分為正常對(duì)照組、單純PDT組、單純TMPyP4組和TMPyP4-PDT組。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞抑制率：將TMPyP4避光保存在4℃冰箱中，用不含胎牛血清的培養(yǎng)基配制成TMPyP4 終濃度分別是 0、3、6、15、30 和 60 μmol/L的孵育液。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成單個(gè)細(xì)胞懸液，以5×103/孔接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加100 μL細(xì)胞懸液，在5%CO2濃度、飽和濕度、37℃孵育箱中培養(yǎng)24 h后，在嚴(yán)格避光的條件下加入上述濃度的TMPyP4孵育液，孵育4 h后，用波長(zhǎng)630 nm、功率800 mW的半導(dǎo)體激光儀垂直照射，能量密度分別是0、2、4和8 J/cm2。照射后所有細(xì)胞換成含10%胎牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加入MTT（5 g/L）20 μL，繼續(xù)避光培養(yǎng) 4 h，終止培養(yǎng)，小心棄上清，加入200 μL DMSO溶解MTT，輕輕震蕩10 min，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定波長(zhǎng)為490 nm處各孔的吸光度（A值）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算各組細(xì)胞的抑制率，細(xì)胞抑制率=1-（實(shí)驗(yàn)組A值/空白組A值）×100%。

1.2.4 形態(tài)學(xué)觀察：各組細(xì)胞處理后繼續(xù)孵育24 h，然后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況和生長(zhǎng)形態(tài)。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡：選取TMPyP4藥物濃度分別是 3、6、15、30 和 60 μmol/L，激光能量密度4 J/cm2為實(shí)驗(yàn)組。將TMPyP4處理后的各組細(xì)胞按照Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒的說明進(jìn)行雙染，即分別消化離心收集各組細(xì)胞，用冷PBS洗3次（1 000 r/min、4℃離心5 min），調(diào)整細(xì)胞濃度為 1×（105~106）/mL，將細(xì)胞懸浮于 200 μL 結(jié)合緩沖液中。加入5 μL的Annexin V-FITC染色液，輕輕混勻，于2~8℃避光條件下孵育15 min，然后加入10 μL PI染色液后于2~8℃避光條件下孵育5 min，在1 h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)TMPyP4-PDT對(duì)宮頸 癌 Caski 細(xì)胞 株 Ki-67、MCM2、P16、CA-Ⅸ 和NF-κBmRNA表達(dá)的影響：收集正常對(duì)照組和TMPyP4-PDT實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，提取總RNA，然后在紫外分光光度儀上測(cè)定RNA的濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，接著進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)PCR，其10 μL反應(yīng)體系為：蒸餾水3.2 μL，SYBR Green Realtime PCR Master Mix 5 μL，10 μmol/L的上游引物和下游引物各0.4 μL，模板DNA 1 μL。引物序列見表1。以GAPDH為內(nèi)參對(duì)Ki-67、MCM2、P16、CA-Ⅸ和 NF-κB 進(jìn)行擴(kuò)增，采用相對(duì)定量法，檢測(cè)TMPyP4-PDT作用24 h后上述基因的mRNA水平。三步法PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 5 s，58 ℃ 10 s，72℃ 15 s，共 40 個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)完成后進(jìn)行融解曲線分析，以確定得到的擴(kuò)增產(chǎn)物是否為單一目的片段。最后由計(jì)算機(jī)自動(dòng)計(jì)算并導(dǎo)出相對(duì)應(yīng)的閾值循環(huán)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組Caski細(xì)胞的A值、凋亡細(xì)胞百分比及Ki-67、MCM2、P16、CA-Ⅸ和 NF-κBmRNA 的表達(dá)水平均以x±s表示，多組間樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2 結(jié)果

2.1 A值測(cè)定結(jié)果

MTT法中，酶聯(lián)檢測(cè)儀各孔的A值可以間接地反映活細(xì)胞數(shù)量，在一定范圍內(nèi)與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。由表2可知：在相同TMPyP4濃度下，隨著激光能量密度的增大A值減小；在相同的激光能量密度照射下，隨著光敏劑濃度的增大A值亦減??；單純PDT組A值變化不明顯。根據(jù)細(xì)胞抑制率繪制出不同TMPyP4濃度對(duì)Caski細(xì)胞株的抑制率曲線（圖1）。在相同的激光能量密度條件下，隨著TMPyP4濃度的增加，PDT效應(yīng)越顯著。單純TMPyP4組對(duì)細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用（P<0.01），且呈劑量依賴性；單純PDT組對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用不明顯（P>0.05）；TMPyP4-PDT組對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用隨著藥物作用濃度及激光能量密度的增加而增強(qiáng)（P<0.01）。

表2 MT T檢測(cè)不同濃度T MP y P 4和不同激光能量密度對(duì)C a s k i細(xì)胞A值的影響Tab.2 Different TMPyP4 concentrations and laser energy densities affect A value of Caski cells by MTT

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

空白對(duì)照組細(xì)胞及單純PDT組細(xì)胞呈多角形或梭形貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞密集，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。單純TMPyP4組細(xì)胞隨著藥物濃度的增加，對(duì)Caski細(xì)胞株的抑制作用逐漸增強(qiáng)，細(xì)胞貼壁稀疏，部分細(xì)胞變成圓形，出現(xiàn)核固縮、空泡樣改變。TMPyP4-PDT組細(xì)胞隨著激光能量密度及藥物濃度的增加，Caski細(xì)胞株的抑制作用逐漸增強(qiáng)，貼壁細(xì)胞數(shù)目明顯減少，出現(xiàn)胞質(zhì)空泡化、細(xì)胞體積縮小、細(xì)胞核碎裂及凋亡小體形成等。各組細(xì)胞的典型形態(tài)學(xué)變化見圖2。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

在激光能量密度為4 J/cm2的條件下，TMPyP4-PDT 組 TMPyP4 濃度為 3、6、15、30 和 60 μmol/L 時(shí)細(xì)胞凋亡率分別為（5.67±0.35）%、（13.50±0.62）%、（22.83±2.35）%、（34.47±1.88）%和（46.43±1.46）%。隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞凋亡率逐漸增加，見圖3。

2.4 TMPyP4-PDT 對(duì) Caski細(xì)胞 Ki-67、MCM2、P16、CA-Ⅸ和 NF-κBmRNA 表達(dá)的影響

在激光能量密度為 4 J/cm2的條件下，3、6、15、30和 60 μmol/L的 TMPyP4作用4 h，Caski細(xì)胞 Ki-67、MCM2、CA-Ⅸ和 NF-κBmRNA 表達(dá)水平明顯降低，P16mRNA表達(dá)水平升高，與正常對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。以GAPDH為內(nèi)參照基因，Ki-67、MCM2、P16、CA-Ⅸ和 NF-κBmRNA 的表達(dá)水平變化見表3。

表3 各組C a s k i細(xì)胞中K i-6 7、MC M2、P 1 6、C A-Ⅸ和N F-κBmR N A表達(dá)變化Tab.3 Changes of expressions of Ki-67，MCM2，P16，CA-Ⅸ and NF-κB mRNA in Caski cells in various groups

3 討論

腫瘤的PDT是繼傳統(tǒng)手術(shù)和放化療之后，正在興起的一種治療腫瘤的新型醫(yī)療技術(shù)。這種治療方法是基于將光敏劑選擇性地富集在腫瘤細(xì)胞里，然后用一定波長(zhǎng)的光激發(fā)產(chǎn)生單態(tài)氧直接損傷腫瘤細(xì)胞并在過氧化反應(yīng)中產(chǎn)生丙二醛，其凋亡途徑可能不依賴caspase-3［8］。與傳統(tǒng)的治療方法相比，PDT最大的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)腫瘤組織選擇性殺傷效率高、毒副作用較小、收效快、重復(fù)應(yīng)用不產(chǎn)生耐藥性、在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)不危及正常組織細(xì)胞等。光敏劑是光動(dòng)力治療的關(guān)鍵［9，10］。TMPyP4 是水溶性陽離子卟啉衍生物，與正常的組織相比，可以在腫瘤組織中蓄積達(dá)到較高的濃度。有研究推測(cè)卟啉可與G-四分體結(jié)合，形成穩(wěn)定的G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，并且可以下調(diào)cmyc和hTERT基因的表達(dá)，抑制端粒酶的活性［11］，將其作用于腫瘤細(xì)胞可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

有研究報(bào)道，Ki-67、MCM2、CA-Ⅸ和 NF-κB 等基因與細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)化有關(guān)，能夠反映細(xì)胞增殖狀態(tài)，有助于預(yù)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)［12~14］。P16基因是繼P53、Rb抑癌基因之后被發(fā)現(xiàn)的又一引人注目的新的抑癌基因，也是人們發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)直接作用于細(xì)胞周期的抑癌基因。P16是多腫瘤抑制基因，抑制細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)換，在細(xì)胞分化周期水平上參與細(xì)胞凋亡的發(fā)生［15，16］。

本研究MTT結(jié)果顯示，A值隨著TMPyP4濃度和照光劑量的增加而降低，單純照光組A值變化不明顯。TMPyP4-PDT對(duì)Caski細(xì)胞有明顯的抑制作用，且其作用呈劑量依賴性。TMPyP4-PDT作用于宮頸癌Caski細(xì)胞后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，倒置顯微鏡下可見胞質(zhì)空泡化、細(xì)胞體積縮小、細(xì)胞核碎裂及凋亡小體形成等凋亡特征性變化。從組織形態(tài)學(xué)以及流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)分析看，PDT可顯著誘導(dǎo)宮頸癌Caski細(xì)胞凋亡。

本研究實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，TMPyP4-PDT處理后的宮頸癌Caski細(xì)胞中Ki-67、MCM2、CA-Ⅸ和NF-κBmRNA表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組（P<0.05），表明TMPyP4-PDT光動(dòng)力作用可以負(fù)性調(diào)節(jié)宮頸癌 Caski細(xì)胞 Ki-67、MCM2、CA-Ⅸ和 NF-κB的表達(dá)水平。而經(jīng)TMPyP4-PDT處理后的Caski細(xì)胞中P16mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組（P＜0.05），提示TMPyP4-PDT光動(dòng)力作用激活了P16基因功能，促使腫瘤細(xì)胞凋亡及壞死。根據(jù)這一結(jié)果推測(cè)TMPyP4-PDT作用于腫瘤細(xì)胞一段時(shí)間后，通過正性調(diào)節(jié) P16以及負(fù)性調(diào)節(jié) Ki-67、MCM2、CA-Ⅸ和NF-κB的表達(dá)從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。

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