地高辛標(biāo)記核酸病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

楊雪，勾文峰，丁蕾，肖麗君，高野康雄，鄭華川

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究室，病理與病理生理研究所，沈陽(yáng) 1 1 0 0 0 1；2.解放軍4 6 3醫(yī)院檢驗(yàn)科，沈陽(yáng)1 1 0 0 4 2；3.承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)部免疫教研室，河北 承德 0 6 7 0 0 0；4.日本神奈川縣立癌中心臨床研究所，橫濱 2 4 1-0 8 1 5）

原位檢測(cè)核酸的病理學(xué)方法主要有原位雜交（in situ hybridization，ISH）和原位 PCR（in situ polymerase chain reaction，ISP）。ISH利用放射性或非放射性標(biāo)記的已知核酸探針，通過(guò)放射自顯影或非放射檢測(cè)系統(tǒng)在組織、細(xì)胞及染色體上檢測(cè)特異DNA或RNA序列，是一種直接、簡(jiǎn)便的研究基因定位和表達(dá)的方法［1］。ISP通過(guò)PCR技術(shù)把固定在細(xì)胞內(nèi)的RNA或DNA進(jìn)行原位擴(kuò)增，對(duì)靶核苷酸進(jìn)行定位、定性、定量分析，該方法敏感性高、特異性強(qiáng)，能在組織細(xì)胞原位進(jìn)行低拷貝數(shù)基因定性［2］。標(biāo)準(zhǔn)ISH的探測(cè)敏感度要求每個(gè)細(xì)胞中大約含有1 000個(gè)拷貝模板，而ISP則可檢測(cè)到細(xì)胞中僅幾個(gè)拷貝模板的核酸［3］。如果在ISP后再進(jìn)行ISH可以大大提高組織切片上核酸檢測(cè)敏感性，本研究擬探討該方法的建立及操作注意事項(xiàng)，說(shuō)明其在病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640或DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2、飽和濕度的環(huán)境下，培養(yǎng)結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT115（低分化型腺癌）（日本東京物化研究所）或JC病毒感染的神經(jīng)母細(xì)胞瘤（JCI）細(xì)胞（由北海道大學(xué)Sawa教授饋贈(zèng)）。收集細(xì)胞，PBS洗2次，-80℃凍存，或常規(guī)制備成石蠟切片。

1.2 病理標(biāo)本

收集日本富山大學(xué)醫(yī)學(xué)部胃癌和肺癌組織各100例，10%甲醛固定，脫水、透明、浸蠟和包埋，制備成石蠟塊，4 μm切片，展片到多聚賴氨酸處理的載玻片上烤片。所有患者手術(shù)前均未經(jīng)放療、化療和生物治療，獲得患者及家屬知情同意和大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 探針制備

提取HCT115細(xì)胞RNA，AMV酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA，制備地高辛標(biāo)記的beclin 1和SERCA3探針；以pBluescrip K（+）-T抗原質(zhì)粒為模板制備地高辛標(biāo)記的JCV T抗原探針。所用引物見表1。100 μL PCR反應(yīng)體系中含引物 F 1 μmol/L，引物 R 1 μmol/L，MgCl22 mmol/L，10×PCR buffer 10 μL，DIG-11-dUTP（Roche Diagnostics，德國(guó)）200 mmol/L，cDNA 模板100 ng，Taq聚合酶2 U。PCR反應(yīng)條件：95℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，循環(huán)30次。Reg IV探針長(zhǎng)度為 122 bp （682~803，GI：36054181），PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳后膠回收純化。

1.4 ISH

4 μm厚切片脫蠟后，經(jīng)胃0.05%蛋白酶（0.2 N HCl，pH2.0）37℃消化30 min，乙醇梯度脫水晾干。每張切片滴加1︰50稀釋的20 μL地高辛標(biāo)記的探針用雜交液（22 mmol/L Tris-HCl pH7.4，2.75 mmol/L EDTA、660 mmol/L NaCl、16 Denhardt solution、5.5%硫酸葡聚糖、0.33%二甲基亞砜、0.55%ethoquad 18/25和44%去離子甲酰胺），覆以蓋玻片，95℃5 min，37℃過(guò)夜。TTBS沖洗10 min，滴加抗地高辛—抗血清堿性磷酸酶（Roche Diagnostics，德國(guó)），37℃20 min。沖洗5 min，浸入solutionⅡ（100 mmol/L Tris-HCl，pH9.5，100 mmol/L NaCl，50 mmol/L MgCl2），室溫15 min，孵育抗地高辛—抗血清堿性磷酸酶過(guò)夜。NBT/BCIP顯色液（紫色）或Fuchsin（紅色）染色，核快紅（粉紅色）或甲基綠（綠色）復(fù)染。

1.5 ISP

10 μm 厚切片經(jīng)蛋白酶 K（20 μg/mL，Dako）37℃消化15 min。PBS沖洗后，4%多聚甲醛固定，2×SSC沖洗。滴加125 μL PCR反應(yīng)體系（0.2 μmol/L引物，序列見表 1，0.125 nmol/L DIG-11-dUTP、2.5 mmol/L MgCl2，1×PCR buffer，6.25 U Taq 聚合酶），蓋膜覆蓋，94 °C 3 min 預(yù)變性，92 °C 15 s，55 °C 15 s，72 °C 30 s，循環(huán) 15 次，72 °C 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度約100 bp。2×SSC 沖洗切片，滴加封閉液（100 μg/mL 鮭魚精子 DNA，100 μg/mL 酵母 tRNA，5%BSA 溶于PBS中）作用1 h。檢測(cè)和復(fù)染方法與ISH相同。

表1 制備探針或I S P所需引物T a b.1 P r i me r s e q u e n c e s f o r p r o b e o r I S P

2 結(jié)果

在ISH中，我們獲得的地高辛標(biāo)記探針DNA為單一條帶，產(chǎn)物經(jīng)過(guò)測(cè)序確認(rèn)。切片經(jīng)過(guò)酶消化后進(jìn)行預(yù)雜交，使切片上細(xì)胞DNA雙鏈解開。探針混入雜交液前要加熱變性后立刻置于冰上，保證探針保持單鏈狀態(tài)。甲酰胺雜交液中42℃雜交過(guò)夜后，洗掉雜交液并加入抗地高辛AP抗體，顯色前經(jīng)過(guò)堿性緩沖液改變切片上組織的pH值，使AP在最佳pH值發(fā)揮分解底物NBT/BCIP或Fuchsin的作用，核快紅或甲基綠復(fù)染后直接干燥，然后浸入二甲苯中透明封片。切記甲基綠復(fù)染切片不能經(jīng)過(guò)乙醇脫水，因?yàn)榧谆G溶于乙醇。如圖1所示，JCV T抗原存在于JCI細(xì)胞的細(xì)胞核中，而在胃癌和肺癌細(xì)胞中未檢測(cè)到JCV T抗原。如圖2所示，beclin 1和SERCA3mRNA陽(yáng)性信號(hào)也見于結(jié)腸癌和癌旁黏膜上皮細(xì)胞質(zhì)中。

在ISP過(guò)程中，必須控制蛋白酶降解的時(shí)間，過(guò)度降解可能導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)受損。PCR反應(yīng)液放入蓋膜里之前要加熱排除混合物中的氣體后再加入Taq DNA聚合酶。如擴(kuò)增的是組織切片，可將PCR反應(yīng)液置于封口膜中。如擴(kuò)增對(duì)象是細(xì)胞，還可以借助組織培養(yǎng)蓋玻片操作。反應(yīng)后，顯示系統(tǒng)和ISH相同。如圖1所示：JCV T抗原DNA存在于JCI細(xì)胞核中。此外，在肺泡上皮細(xì)胞和肺癌細(xì)胞核、胃癌及癌旁黏膜細(xì)胞核中也發(fā)現(xiàn)了JCV T抗原陽(yáng)性信號(hào)（圖 3）。

3 討論

ISH探針的制備主要采用缺口平移法、隨機(jī)引物法或PCR擴(kuò)增合成，同位素標(biāo)記探針的制備常用末端標(biāo)記法。目前認(rèn)為利用地高辛標(biāo)記UTP進(jìn)行PCR擴(kuò)增較簡(jiǎn)便、安全，適合大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室。ISH最關(guān)鍵的步驟是分子雜交，根據(jù)分子雜交的原理，在雜交過(guò)程中必須讓探針和目標(biāo)核酸處盡量處于單鏈狀態(tài)。本研究所用雜交液中的甲酰胺可破壞氫鍵，使核酸解開雙螺旋狀態(tài)，硫酸葡聚糖的DNA有濃縮作用，可將雜交反應(yīng)速度提高10倍以上。封阻DNA濃度通常為探針DNA的1~100倍，作用是雜交掉探針中的相似序列，阻止探針DNA與非目標(biāo)DNA的粘連。雜交應(yīng)在25℃（基因組ISH一般是37℃）、避光恒溫條件下進(jìn)行，持續(xù)時(shí)間12~20 h。在此期間應(yīng)注意保濕，可將濕盒置于42℃溫箱中，或?qū)㈦s交爐上面的面板條浸濕。在檢測(cè)mRNA表達(dá)的過(guò)程中，雜交過(guò)夜前一定要盡量保持RNase-free的操作條件。本研究中，在JCI細(xì)胞核中成功檢測(cè)到JCV T抗原DNA，而在肺癌和胃癌組織中則未檢測(cè)到，可能因其檢測(cè)感度較低所致［4，5］。在結(jié)直腸癌細(xì)胞質(zhì)中我們也檢測(cè)到beclin 1和SERCA3mRNA的表達(dá)。我們的經(jīng)驗(yàn)提示，如果結(jié)直腸癌組織樣品進(jìn)行RT-PCR 30個(gè)循環(huán)可以檢測(cè)到目的基因，就能利用ISH成功檢測(cè)到其mRNA表達(dá)。

ISP既有分子雜交特異、靈敏的特點(diǎn)，同時(shí)又有組織細(xì)胞化學(xué)染色的可見性，且其應(yīng)用范圍廣泛，可對(duì)特定基因（如癌基因、病毒基因）DNA、mRNA的表達(dá)進(jìn)行定位、定性和定量［2］。本研究中，主要針對(duì)JCV T抗原DNA進(jìn)行了ISP擴(kuò)增，并在肺癌和胃癌細(xì)胞和癌旁正常細(xì)胞核中檢測(cè)到其陽(yáng)性信號(hào)［3~5］。ISP與ISH不同之處在于組織切片在PCR前要進(jìn)行細(xì)胞固定，旨在保存細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，本研究使用的4%中性多聚甲醛固定效果比較好。固定時(shí)間以30~60 min為宜，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能導(dǎo)致核酸和蛋白交聯(lián)，影響PCR擴(kuò)增效率。隨后的蛋白酶消化的目的是解除醛類固定劑所致的核酸與蛋白質(zhì)交聯(lián)，防止形成網(wǎng)絡(luò)性屏障結(jié)構(gòu)，使得PCR反應(yīng)試劑充分透入，同時(shí)也能更好地暴露DNA。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度不可過(guò)短或過(guò)長(zhǎng)，產(chǎn)物太短容易擴(kuò)散，而過(guò)長(zhǎng)則擴(kuò)增效率受影響。引物可用1對(duì)或多對(duì)，產(chǎn)物長(zhǎng)度一般在100~200 bp。循環(huán)數(shù)應(yīng)根據(jù)模板量進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，循環(huán)數(shù)過(guò)大可導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，太小則易致假陰性。

本研究所用ISP為直接法，把標(biāo)記核苷酸（如Dig-11-dUTP）直接混入PCR反應(yīng)液中，隨著擴(kuò)增的進(jìn)行，標(biāo)記的核苷酸直接摻入到PCR產(chǎn)物中。還可采用間接法ISP，原位核酸擴(kuò)增后進(jìn)行ISH檢測(cè)，可提高檢測(cè)敏感度和特異度，但耗時(shí)較多。此外，還可行原位反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增，應(yīng)注意的是組織要經(jīng)過(guò)DNA酶處理去除細(xì)胞固有DNA，降低擴(kuò)增模板噪聲。在顯色方面，無(wú)論ISH還是ISP，NBT/BCIP比Fuchsin的顯色要強(qiáng)，F(xiàn)uchsin顯色過(guò)5 min后形成沉淀。

總之，為了獲得敏感、特異和可信的結(jié)果，應(yīng)根據(jù)研究條件選擇核酸的原位檢測(cè)技術(shù)，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要注意實(shí)驗(yàn)原理和操作的關(guān)鍵點(diǎn)。本研究所建立的地高辛標(biāo)記的ISH和ISP操作簡(jiǎn)便、敏感度高，NBT/BCIP顯色和甲基綠復(fù)染的圖像清晰，適用于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室。

［1］劉勇，楊海玉.原位雜交的技術(shù)關(guān)鍵及其應(yīng)用［J］.江西醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)，2006，24（6）：560-562.

［2］胡宜，王靜舒.原位 PCR 技術(shù)（in situ PCR）［J］.日本醫(yī)學(xué)介紹，2003，24（1）：47.

［3］Zheng H，Murai Y，Hong M，et al.JC virus detection in human tissue specimens［J］.J Clin Pathol，2007，60（7）：787-793.

［4］Zheng H，Abdel Aziz HO，Nakanishi Y，et al.Oncogenic role of JC virus in lung cancer［J］.J Pathol，2007，212（3）：306-315.

［5］Murai Y，Zheng HC，Abdel Aziz HO，et al.High JC virus load in gastric cancer and adjacent non-cancerous mucosa ［J］.Cancer Sci，2007，98（1）：25-31.