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    飼喂十字花科類(lèi)植物對(duì)生鮮牛乳中硫氰酸鈉含量的影響研究

    2012-11-14 08:02:46吳劍平李丹妮方絲蕓
    中國(guó)獸藥雜志 2012年10期
    關(guān)鍵詞:青飼料十字花科硫氰酸

    吳劍平,張 鑫,顧 欣,李丹妮,嚴(yán) 鳳,方絲蕓

    (上海市獸藥飼料檢測(cè)所,上海 201103)

    牛乳中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),為微生物提供了良好的生長(zhǎng)環(huán)境,因此牛乳極易腐敗變質(zhì)。在牛乳中添加硫氰酸鈉后可有效抑菌、保鮮及延長(zhǎng)牛乳的保存期,但是,硫氰酸鈉也是毒害品,過(guò)量攝入會(huì)對(duì)人體造成危害,2008年12月衛(wèi)生部發(fā)布的《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑名單(第一批)》中明確規(guī)定硫氰酸鈉屬于違法添加物質(zhì)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[1-2],硫氰酸鈉作為硫代糖苷和生氰糖苷的代謝產(chǎn)物而普遍存在于生鮮牛乳中,十字花科類(lèi)植物因?yàn)楦缓虼擒斩赡艹蔀榉侨藶樘砑拥纳r牛乳中硫氰酸鈉的主要來(lái)源之一。我國(guó)奶牛作為青飼料經(jīng)常飼喂的十字花科類(lèi)植物包括花椰菜、卷心菜和一些甘藍(lán)菜的莖葉,油菜花屬于十字花科類(lèi)蕓苔屬,其榨油后的菜籽餅也被常用作奶牛的蛋白補(bǔ)充飼料。因此,有必要研究飼喂十字花科類(lèi)植物對(duì)生鮮牛乳中硫氰酸鈉含量的影響,以確定生鮮牛乳中非人為添加的硫氰酸鈉含量本底值。

    目前已建立了高效液相色譜法與毛細(xì)管色譜法檢測(cè)牛奶中硫氰酸鈉含量,其中高效液相色譜法具有定量準(zhǔn)確、專一性強(qiáng)的特點(diǎn)[3-4]。該方法可適用于生鮮乳和巴氏滅菌成品乳,檢測(cè)限可達(dá)到0.2 mg/kg,定量范圍0.5 ~50 mg/kg,精確度 <10%,回收率>90%。本研究通過(guò)該方法檢測(cè)生鮮牛乳中的硫氰酸鈉含量,通過(guò)對(duì)所得含量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得到飼喂十字花科類(lèi)植物對(duì)生鮮牛乳中硫氰酸鈉含量的影響規(guī)律。

    1 儀器、材料與試藥

    1.1 儀器 Waters高效液相色譜系統(tǒng)(2695-2998二極管陣列檢測(cè)器,Empower?色譜工作站);高速冷凍離心機(jī)(Allegra X-22R,BECKMAN COULTER);AL204電子天平,梅特勒-托利多儀器有限公司;減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(B-490,BUCHI);十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱(Agela-ASB?C18,250 mm ×4.6 mm,5 μm)。

    1.2 材料與試藥 堿性氧化鋁SPE固相萃取柱(Agela-Cleanert? ,1000 mg ×6 mL);硫氰酸鈉(98.5%,ALDRICH);磷酸(分析純);三乙胺(分析純);乙睛(色譜純);甲醇(色譜純);正丙醇(分析純);去離子水(自制,電阻率>10 MΩ·cm)。

    2 方法和結(jié)果

    2.1 色譜條件 色譜柱:Agela-ASB-C18(250 mm ×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖液∶甲醇=95∶5;柱溫30℃;流速0.8 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)228 nm;進(jìn)樣量10 μL。在上述色譜條件下,對(duì)空白、標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣品溶液進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗(yàn),典型色譜圖如圖1所示。

    圖1 典型色譜圖

    2.2 前處理?xiàng)l件 精密量取樣品5.00 mL,置50 mL具塞離心管中,加入乙睛15 mL,密塞強(qiáng)烈振搖提取3 min后,至高速冷凍離心機(jī)中,4℃下8000 r/min離心3 min,小心取出全部上層清液,過(guò)堿性氧化鋁SPE柱,擠干,收集全部流出液于100 mL梨型瓶中,加入1 mL正丙醇,置60℃恒溫水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,精密加入1.00 mL磷酸鹽緩沖液,振蕩溶解后,置2 mL TIP離心管中,14000 r/min離心3 min脫脂后取水層溶液過(guò) 0.45 μm濾膜,待測(cè)。

    2.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

    2.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選取與分組 選用健康的產(chǎn)奶乳牛20頭,產(chǎn)奶階段、產(chǎn)奶量、體重、胎次和年齡基本相近,分為空白組、卷心菜葉組、花椰菜葉組、2倍花椰菜葉組,每組各5頭,記錄每頭奶牛的編號(hào),在開(kāi)始試驗(yàn)前停止飼喂含十字花科類(lèi)植物的青飼料1個(gè)月。

    2.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼喂 各實(shí)驗(yàn)組除青飼料以外其他日糧相同,每日分三次定時(shí)飼喂(凌晨3:00,上午10:00,午后17:00),其中精飼料每頭份每餐4 kg,配方為玉米48%、大麥10%、麩皮5%、玉米皮8%、豆粕9%、DDGS 15%、磷酸鈣2%、蘇打1.5%、碳酸鈣1.5%、食鹽1%;粗飼料每頭份每餐6 kg,主要為干牧草與干花生莖葉。青飼料依據(jù)組別各不相同,具體每餐每頭份飼喂情況如表1所示。

    表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每餐每頭份飼喂量表

    2.3.3 試樣的采集 采用人工擠奶方式,每天進(jìn)行三次采奶,具體時(shí)間為每次投料飼喂之后。擠奶前對(duì)每個(gè)乳頭進(jìn)行消毒液消毒,并將消毒液擦拭干凈后進(jìn)行擠奶,棄去每個(gè)乳區(qū)的前20 mL乳液,每個(gè)乳頭分別采樣50 mL,混合均勻后進(jìn)行封裝。樣品使用保溫箱與冰袋進(jìn)行冷藏運(yùn)輸,采樣當(dāng)日進(jìn)行含量測(cè)定。

    2.3.4 組內(nèi)個(gè)體差異的排除 對(duì)卷心菜葉組5頭牛分別進(jìn)行了連續(xù)5 d早中晚共計(jì)15次采樣測(cè)定,其結(jié)果見(jiàn)圖2。將每次采樣的均值作為基準(zhǔn)大部分?jǐn)?shù)據(jù)點(diǎn)都落在其正負(fù)3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍內(nèi),該結(jié)果說(shuō)明,該組參與試驗(yàn)的牛中除了有4個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)未落在3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍內(nèi)的B4號(hào)牛都基本處于正常情況,沒(méi)有顯著的組間差異,其含量可以用除B4號(hào)牛之外的4頭牛所產(chǎn)生鮮乳的含量均值進(jìn)行分析,其他三組也以相同方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

    圖2 組內(nèi)個(gè)體差異圖

    2.3.5 日內(nèi)差異的排除 對(duì)B組飼喂卷心菜葉的連續(xù)5 d日間三次所采得奶樣進(jìn)行了含量測(cè)定,將其含量均值作圖,其結(jié)果見(jiàn)圖3。所得結(jié)果表明,同一天內(nèi)早中晚三次采樣的數(shù)據(jù)沒(méi)有超過(guò)同組當(dāng)日均值的正負(fù)3倍標(biāo)準(zhǔn)差范圍,其差異并不顯著,而大部分情況下中午所采集的奶樣接近均值,因此可以取中午所采集點(diǎn)的數(shù)據(jù)表征當(dāng)日含量值。

    圖3 日內(nèi)個(gè)體差異圖

    2.3.6 4組加量飼喂試驗(yàn) 對(duì)所有進(jìn)行試驗(yàn)的4組奶牛停止飼喂青飼料一個(gè)月后,按照飼喂計(jì)劃開(kāi)始加量飼喂試驗(yàn),取各組中午11:00飼喂之后所采生鮮乳進(jìn)行高效液相色譜法檢測(cè)其中硫氰酸鈉含量,取沒(méi)有異常情況的樣品含量均值與標(biāo)準(zhǔn)差作圖,其結(jié)果見(jiàn)圖4。所得結(jié)果表明,通過(guò)比較每組當(dāng)日含量均值及其加減標(biāo)準(zhǔn)差后的范圍,飼喂十字花科類(lèi)植物的B、C、D三組的乳中硫氰酸鈉含量顯著高于空白對(duì)照組;且其加減標(biāo)準(zhǔn)差后的范圍也不與之有重疊,三組中飼喂卷心菜葉的B組乳中硫氰酸鈉含量顯著低于飼喂花椰菜葉的C組與D組;C組與D組相比,D組乳中硫氰酸鈉含量的上升速度較快,但是在6 d以后兩組的乳中硫氰酸鈉含量趨于穩(wěn)定后,含量接近且其加減標(biāo)準(zhǔn)差的范圍重疊,因此其差異并不十分顯著。

    圖4 4組加量飼喂試驗(yàn)(各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的SD值)

    2.3.7 體內(nèi)消除試驗(yàn) 飼喂8 d后飼喂花椰菜葉的C組與D組乳中的硫氰酸鈉含量趨于穩(wěn)定且其含量趨同。從第9天開(kāi)始對(duì)D組進(jìn)行停止飼喂花椰菜葉的體內(nèi)消除試驗(yàn),同時(shí)對(duì)繼續(xù)按時(shí)按量飼喂花椰菜葉的C組和空白對(duì)照組進(jìn)行采樣測(cè)定,所得結(jié)果見(jiàn)圖5。通過(guò)比較每日含量均值與其加減標(biāo)準(zhǔn)差的范圍,所得結(jié)果表明停止飼喂花椰菜葉3 d后,D組乳中硫氰酸鈉含量相比正常飼喂的C組有明顯下降,當(dāng)?shù)竭_(dá)5 d之后D組的含量均值到達(dá)第一個(gè)平臺(tái)期,當(dāng)?shù)竭_(dá)9 d后其含量又再次快速下降,到11 d又達(dá)到第二個(gè)平臺(tái)期,且其含量值與空白對(duì)照組A組的含量趨同。

    圖5 消除規(guī)律圖(各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的SD值)

    3 討論

    研究表明,十字花科類(lèi)植物富含產(chǎn)生硫氰酸鹽的生氰糖苷和異硫糖苷,云苔屬類(lèi)植物可達(dá)100 mg/kg,甘藍(lán)類(lèi)植物也可達(dá)到 250 mg/kg[6],但未有關(guān)于奶牛飼喂十字花科類(lèi)植物對(duì)產(chǎn)奶中硫氰酸鈉含量影響的研究。據(jù)國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道,南美洲個(gè)體奶牛間的生鮮乳中硫氰酸鈉含量在2.3~35 mg/kg范圍內(nèi),其中未經(jīng)人為添加的散裝生鮮乳中硫氰酸鈉含量大約為8 mg/kg[7],而一般采用乳過(guò)氧化酶體系進(jìn)行保鮮處理的生鮮乳中需要人為添加15 mg/kg以上。因此,在實(shí)際生產(chǎn)中生鮮牛乳中非人為添加的硫氰酸鈉含量應(yīng)在2~15 mg/kg范圍內(nèi),而飼喂十字花科類(lèi)植物作為青飼料其每頓的飼喂量難以超過(guò)5 kg,試驗(yàn)中若再增加飼喂量,容易造成奶牛消化不良拉稀。通過(guò)對(duì)乳中硫氰酸鈉含量的安全評(píng)價(jià)可知[1],乳中硫氰酸鈉含量在20 mg/kg以內(nèi)是安全的,因此從本文的研究結(jié)果看,按正常量飼喂十字花科類(lèi)植物不會(huì)造成生鮮牛乳中硫氰酸鈉含量超過(guò)正常水平。

    在相同飼喂條件下,同組正常乳牛所分泌的乳中硫氰酸鈉含量應(yīng)符合隨機(jī)分布,因此其中個(gè)體含量落在其組內(nèi)均值的正負(fù)3倍標(biāo)準(zhǔn)差范圍內(nèi)的概率應(yīng)大于99.73%[5],因此認(rèn)為其中超出范圍的點(diǎn)偏離了組群的正常水平,判定為異常數(shù)據(jù)點(diǎn),而當(dāng)某試驗(yàn)動(dòng)物連續(xù)出現(xiàn)異常數(shù)據(jù)時(shí)應(yīng)該舍棄該動(dòng)物所提供的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。正是基于此原理對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了組內(nèi)個(gè)體差異和日內(nèi)差異的消除,確定了加量飼喂試驗(yàn)與體內(nèi)消除試驗(yàn)的數(shù)據(jù)采集方式。

    通過(guò)加量飼喂試驗(yàn)可知,當(dāng)同樣處于停止飼喂青飼料的奶牛開(kāi)始飼喂十字花科類(lèi)植物后其乳中硫氰酸鈉含量明顯高于仍然停喂青飼料的空白對(duì)照組,說(shuō)明飼喂十字花科類(lèi)植物作為青飼料可使生鮮牛乳中硫氰酸鈉含量提高;在飼喂量相同的情況下,花椰菜葉組的乳中硫氰酸鈉含量明顯高于卷心菜葉組,說(shuō)明飼喂不同類(lèi)型的十字花科類(lèi)植物對(duì)乳中硫氰酸鈉含量的影響不同,花椰菜葉相比卷心菜葉可以使乳中硫氰酸鈉含量提高更多;在同樣飼喂花椰菜葉的兩組中,以兩倍于平時(shí)飼喂量飼喂的D組乳中硫氰酸鈉含量升高較快,但是當(dāng)其含量升高至趨穩(wěn)后,兩者的含量均達(dá)到6~7 mg/kg,較為接近,說(shuō)明當(dāng)十字花科類(lèi)植物的飼喂量達(dá)到一定水平后,再提高飼喂量對(duì)生鮮乳中硫氰酸鈉含量的提高幫助不大,推測(cè)可能是乳牛本身對(duì)硫代糖苷和生氰糖苷的吸收轉(zhuǎn)化率有一定的極限。另外,在停止飼喂一個(gè)月后的空白對(duì)照組在試驗(yàn)過(guò)程中始終能檢測(cè)到乳中硫氰酸鈉含量在1~2 mg/kg,而且在體內(nèi)消除實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中也能檢測(cè)到其始終維持在這一水平,說(shuō)明飼喂十字花科類(lèi)植物不是影響生鮮牛乳中硫氰酸鈉含量的唯一因素。

    通過(guò)體內(nèi)消除試驗(yàn)可知,當(dāng)乳中硫氰酸鈉含量趨穩(wěn)的飼喂組停止飼喂3 d后就能觀察到其乳中硫氰酸鈉含量的明顯下降,但到5 d時(shí)會(huì)下降到達(dá)第一個(gè)平臺(tái)期,推測(cè)可能與牛的反芻現(xiàn)象有關(guān),其積存在瘤胃中的十字花科類(lèi)植物通過(guò)反芻維持了其乳中硫氰酸鈉的含量,而當(dāng)達(dá)到9 d以后其乳中硫氰酸鈉含量再次下降,直至達(dá)到與空白對(duì)照組相近的水平,驗(yàn)證了本市天然生鮮牛乳中硫氰酸鈉含量的影響主要來(lái)自于十字花科類(lèi)植物。

    [1]顧 欣,黃士新,李丹妮,等.乳中硫氰酸鹽對(duì)人類(lèi)健康的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[J].中國(guó)獸藥雜志,2010,44(9):45-49.

    [2]李 鮮,陳昆松,張明方,等.十字花科類(lèi)植物中的硫代葡萄糖苷的研究進(jìn)展[J].園藝學(xué)報(bào),2006,37(3):15-17

    [3]吳劍平,顧 欣,李丹妮,等.高效液相色譜法檢測(cè)牛奶中硫氰酸鈉質(zhì)量濃度[J].中國(guó)乳品工業(yè),2011,39(7):44-46.

    [4]吳劍平,顧 欣,李丹妮,等.毛細(xì)光電泳法檢測(cè)牛奶中硫氰酸鈉質(zhì)量濃度[J].中國(guó)乳品工業(yè),2012,40(3):53-56.

    [5]GB/T 4091-2001,常規(guī)控制圖的理解與實(shí)施[S].

    [6]WHO.Evaluation of Certain Food Additives and Contaminants[R].Geneva,1990.

    [7]Ponec C.Reports of Field Studies from Cuba and Other South-American and Centeral-American coutries Personaled at the Technical Meeting on the Benefits and Potential Risks of the LP-system of Raw milk Preservation[R].Rome,2005.

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