Ras基因蛋白的表達(dá)及基因突變與皮膚病理性瘢痕和瘢痕癌的相關(guān)性

郭瑞珍，王海青，胡成久，邊 可

(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū) 病理學(xué)教研室，廣東 珠海 519041)

·臨床醫(yī)學(xué)研究·

Ras基因蛋白的表達(dá)及基因突變與皮膚病理性瘢痕和瘢痕癌的相關(guān)性

郭瑞珍，王海青，胡成久，邊 可

(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū) 病理學(xué)教研室，廣東 珠海 519041)

目的探討Ras基因家族(K-ras、H-ras、N-ras)蛋白的表達(dá)和基因突變與病理性瘢痕上皮癌變和瘢痕癌發(fā)生的相關(guān)性。方法用激光掃描共聚焦顯微技術(shù)檢測(cè)皮膚病理性瘢痕和瘢痕癌組織中K-ras、H-ras、N-ras免疫熒光蛋白表達(dá)；免疫組織化學(xué)技術(shù)(SP)法檢測(cè)正常皮膚、病理性瘢痕和瘢痕癌組織中K-ras、H-ras、N-ras蛋白的表達(dá)；從病理性瘢痕和瘢痕癌組織中提取DNA，分析K-ras、H-ras、N-ras基因第12、13 位密碼子突變情況。所有數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS16.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果①K-ras、H-ras、N-ras3種蛋白在病理性瘢痕上皮中呈現(xiàn)較弱熒光，為弱陽(yáng)性表達(dá)，在瘢痕癌組織中呈現(xiàn)較強(qiáng)熒光，為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。②3種蛋白在正常皮膚表皮、病理性瘢痕上皮和瘢痕癌組織中分別呈陰性或弱陽(yáng)性、弱陽(yáng)性或陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。瘢痕癌組表達(dá)水平(陽(yáng)性面積)、表達(dá)強(qiáng)度(平均光密度)與正常皮膚、病理性瘢痕組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.01；P﹤0.05)；但正常皮膚組與病理性瘢痕組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹥0.05)。③病理性瘢痕和瘢痕癌中均未發(fā)現(xiàn)K-ras、H-ras、N-ras基因12、13位密碼子突變。結(jié)論①瘢痕癌的發(fā)生與K-ras、H-ras、N-ras蛋白的高表達(dá)有相關(guān)性；②病理性瘢痕上皮和瘢痕癌組織中不存在K-ras、H-ras、N-ras基因12、13位密碼子突變。③病理性瘢痕上皮中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)癌變?cè)缙谛盘?hào)。

病理性瘢痕；瘢痕癌；Ras基因；突變；癌變

皮膚病理性瘢痕是一種癌前病變，病理性瘢痕被覆上皮癌變而形成的癌稱之為瘢痕癌。由于至今未能成功復(fù)制病理性瘢痕和瘢痕癌的動(dòng)物模型提供研究，致使目前與瘢痕癌的發(fā)生和瘢痕上皮癌變的相關(guān)性研究極少有報(bào)道。Ras基因是較早被鑒定的人類癌基因之一，其基因家族包含H-ras、N-ras、K-ras 3種功能性基因，研究認(rèn)為，Ras基因的異常高表達(dá)和基因突變與多種人類惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)【1,2】，而且，Ras基因的異常高表達(dá)和基因突變，可出現(xiàn)在許多癌前病變中，認(rèn)為可用檢測(cè)Ras癌基因的方法對(duì)癌變傾向提供較早信息【3】。本組從蛋白水平、基因突變的水平，對(duì)比分析Ras基因與瘢痕癌的發(fā)生和病理性瘢痕癌變的相關(guān)性，其研究結(jié)果及意義如下。

1 材料與方法

1.1 材料 檢測(cè)組織均為10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，HE染色，光鏡觀察確診。標(biāo)本源于遵義醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院和第五附屬醫(yī)院病理科。正常皮膚取自臨床手術(shù)切除的帶有正常皮膚組織的病變標(biāo)本；病理性瘢痕病例臨床有皮膚燒傷、燙傷或機(jī)械性創(chuàng)傷等損傷史，有瘢痕形成時(shí)間記載的13例，分別為5個(gè)月、3年、58年和60年各1例，10年3例，20年4例，30年2例。病變部位有胸部、大腿、小腿等處；瘢痕癌病例臨床有瘢痕形成史，有癌變時(shí)間記載的5個(gè)病例，分別于瘢痕形成后21年、18年、18年、12年和10年發(fā)生癌變。病變部位有頭面部、上肢、下肢等處。組織學(xué)類型均為鱗狀細(xì)胞癌。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

1.2.1 熒光免疫試劑 鼠抗人H-ras多克隆抗體，購(gòu)自美國(guó)SANTA公司；兔抗人N-ras、K-ras多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德公司；羊抗兔FITC抗體、羊抗鼠Cy3抗體購(gòu)自北京中衫金橋公司。

1.2.2 免疫組織化學(xué)試劑 兔抗人K-Ras 、H-Ras 、N-Ras多克隆抗體，購(gòu)自武漢博士德公司。

1.2.3 基因突變檢測(cè)主要試劑 AxyPrep基因組DNA提取試劑盒由上海百賽公司提供； PCR反應(yīng)試劑盒由北京天根公司提供；引物設(shè)計(jì)和引物序列參照文獻(xiàn)進(jìn)行【4】，由上海生物工程公司合成。

表1 H-ras、 N-ras 和K-ras基因第12、13位密碼子引物序列及擴(kuò)增片段

1.3 實(shí)驗(yàn)方法及步驟

1.3.1 組織切片 福爾馬林固定，石蠟包埋標(biāo)本，連續(xù)切片4張(4μm厚)，撈片于防脫片上，60℃烤干，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 激光掃描共聚焦顯微技術(shù) 抗體搭配及要求:免疫熒光雙標(biāo)染色，所用一抗有K-Ras(兔抗人)、H-Ras(鼠抗人)、N-Ras(兔抗人)；二抗有Cy3(羊抗兔、波長(zhǎng)570nm)、FITC(羊抗鼠)、波長(zhǎng)468nm)。雙標(biāo)抗體搭配 ：K-Ras(二抗：Cy3)/ H-Ras(二抗：FITC)、N-Ras(二抗：Cy3)/ H-Ras(二抗：FITC)，實(shí)驗(yàn)步驟：石蠟切片常規(guī)脫臘至水，微波抗原修復(fù)；操作步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，用抗淬滅的熒光封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡掃描并合成圖片。

1.3.3 免疫組織化學(xué)技術(shù)(SP法) 用結(jié)腸癌組織切片作陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作空白對(duì)照。切片經(jīng)脫臘、流水沖洗，微波修復(fù)抗原，按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，DAB顯色后，經(jīng)復(fù)染、透明、封片，光鏡觀察。

1.3.4 基因突變檢測(cè)技術(shù) 對(duì)28個(gè)病例(病理性瘢痕和瘢痕癌各14例)按AxyPrep基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行DNA提取；PCR擴(kuò)增序列片段長(zhǎng)度：K-ras序列為162 bp，H-ras序列為170 bp，N-ras序列為183 bp。測(cè)序：擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工公司 雙向測(cè)序。

1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷

1.4.1 激光共聚焦顯微技術(shù)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 免疫熒光雙標(biāo)的石蠟切片，在倒置Leica熒光顯微鏡通過(guò)綠色、紅色通道可以觀察到陽(yáng)性的熒光信號(hào)判斷為實(shí)驗(yàn)成功，陽(yáng)性熒光信號(hào)定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜。其中綠色熒光信號(hào)代表FITC標(biāo)記的陽(yáng)性信號(hào)；紅色熒光信號(hào)代表Cy3標(biāo)記的陽(yáng)性信號(hào)；兩種陽(yáng)性熒光信號(hào)疊加呈現(xiàn)黃色。經(jīng)激光共聚焦顯微鏡掃描并拍照，合成后獲得三維立體結(jié)構(gòu)圖像。

1.4.2 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 3種蛋白均以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。采用半定量積分法，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和染色強(qiáng)度計(jì)分的乘積分為4個(gè)等級(jí)，<2分為陰性(-)，2～3分為弱陽(yáng)性(+)，4～6分為陽(yáng)性(++)，>6分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)，≥6分為高表達(dá)，<6分為低表達(dá)，<2分為陰性。運(yùn)用CCD成像系統(tǒng)，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，應(yīng)用顯微圖像分析系統(tǒng)分別檢測(cè)陽(yáng)性染色的表達(dá)水平(即陽(yáng)性面積代數(shù)和與分析區(qū)域面積的比值，值越大，陽(yáng)性表達(dá)水平越高)和表達(dá)強(qiáng)度(即平均光密度值，值越大，陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度越高)，各取平均值，最后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4.3 PCR擴(kuò)增結(jié)果判斷與檢測(cè) PCR擴(kuò)增觀察到162bp的K-ras、170bp的H-ras和183bp的N-ras的單一條帶表明擴(kuò)增成功。 擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工公司測(cè)序，用Chromas軟件分析DNA測(cè)序圖譜，并運(yùn)用Geneious軟件與其正?；蛐蛄羞M(jìn)行比對(duì)，查找突變位點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 激光掃描共聚焦顯微技術(shù)雙標(biāo)記結(jié)果 在倒置Leica熒光顯微鏡下，通過(guò)綠色、紅色通道可見(jiàn)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的H-Ras蛋白的陽(yáng)性信號(hào)為綠色熒光； Cy3標(biāo)記的K-Ras、N-Ras蛋白的陽(yáng)性信號(hào)為紅色熒光；兩種熒光信號(hào)重疊部位呈黃色，陽(yáng)性信號(hào)定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜。其中病理性瘢痕上皮中陽(yáng)性熒光信號(hào)較弱，呈弱表達(dá)，瘢痕癌組織中陽(yáng)性熒光信號(hào)較強(qiáng)，呈強(qiáng)表達(dá)(見(jiàn)圖1,圖2)。

注：A 病理性瘢痕上皮中H-ras呈現(xiàn)較弱綠色熒光；K-ras呈現(xiàn)較弱紅色熒光；共同表達(dá)的部位呈黃色熒光。B 瘢痕癌組織中H-ras 呈現(xiàn)較強(qiáng)綠色熒光；K-ras呈現(xiàn)較強(qiáng)紅色熒光；共同表達(dá)的部位呈黃色熒光。圖1 病理性瘢痕上皮和瘢痕癌組織中H-ras /K-ras雙標(biāo)記免疫熒光(×400)

注：A 病理性瘢痕上皮中H-ras呈現(xiàn)較弱綠色熒光；N-ras呈現(xiàn)較弱紅色熒光；共同表達(dá)的部位呈黃色熒光。B 瘢痕癌組織中H-ras呈現(xiàn)較強(qiáng)綠色熒光；N-ras呈現(xiàn)較強(qiáng)紅色熒光；共同表達(dá)的部位呈黃色熒光。圖2 病理性瘢痕上皮和瘢痕癌組織中H-ras/N-ras雙標(biāo)記免疫熒光(×400)

2.2 免疫組織化學(xué)標(biāo)記結(jié)果的表達(dá) H-ras、N-ras、K-ras 3種蛋白陽(yáng)性表達(dá)信號(hào)呈棕黃色、顆粒狀，主要定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜。在正常皮膚表皮中呈陰性或弱陽(yáng)性表達(dá)，弱陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量較少，見(jiàn)于基底細(xì)胞層，不見(jiàn)于顆粒層和棘細(xì)胞層；在瘢痕上皮中呈弱陽(yáng)性或陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)較正常皮膚表皮增多，見(jiàn)于基底細(xì)胞層、顆粒層和棘細(xì)胞層；在瘢痕癌中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(見(jiàn)圖3～圖5)。其表達(dá)水平(陽(yáng)性面積)、表達(dá)強(qiáng)度(平均光密度)在正常皮膚、皮膚瘢痕和瘢痕癌之間有差異(H-rasFPA=22.807，PPA﹤0.001；FOD=20.808，POD﹤0.001，)，(N-rasFPA=10.220，PPA﹤0.001；FOD=6.698，POD=0.003)，(K-rasFPA=10.295，PPA﹤0.001；FOD=3.506，POD=0.039)，瘢痕癌組分別與正常皮膚組和瘢痕組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.01；P﹤0.05)，但正常皮膚組與瘢痕組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹥0.05),(見(jiàn)表2)。

注：A 正常皮膚表皮中呈陰性；B 病理性瘢痕上皮中呈弱陽(yáng)性表達(dá) ；C瘢痕癌組織中中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。圖3 正常皮膚表皮、病理性瘢痕上皮和瘢痕癌組織中H-ras蛋白的表達(dá)(IHC ×400)

注:A 正常皮膚表皮中呈陰性表達(dá)；B在皮膚瘢痕上皮中呈弱陽(yáng)性表達(dá)；C在皮膚瘢痕癌中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。圖4 正常皮膚表皮、病理性瘢痕上皮和瘢痕癌組織中N-ras蛋白的表達(dá)(IHC×400)

注：A 正常皮膚表皮中呈弱陽(yáng)性表達(dá)；B皮膚瘢痕上皮中呈弱陽(yáng)性表達(dá)；C皮膚瘢痕癌中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。圖5 正常皮膚表皮、病理性瘢痕上皮和瘢痕癌組織中K-ras蛋白的表達(dá)(IHC×400)

表2 H-ras、N-ras、K-ras蛋白在各組組織中的表達(dá)

注：PA代表陽(yáng)性面積代數(shù)和/分析區(qū)域面積的比值；OD代表平均光密度。與正常皮膚和瘢痕組比，*P<0.05；**P<0.01。

2.3 基因突變檢測(cè)結(jié)果 擴(kuò)增、測(cè)序結(jié)果28個(gè)樣本(病理性瘢痕和瘢痕癌各14例)均成功擴(kuò)增出K-ras(162bp)、H-ras(170bp)和N-ras(183bp)的基因片段，凝膠電泳均顯示為單一條帶(見(jiàn)圖6)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序均未檢測(cè)出K-ras、H-ras和N-ras基因第12、13位密碼子突變。

注：M為DNA marker；A H-ras基因，1為瘢痕，2、3、4、5、6為瘢痕癌；B N-ras基因,1、2為瘢痕，3、4、5、6、7為瘢痕癌；C K-ras基因,1、2為瘢痕，3、4、5、6為瘢痕癌。圖6 H-ras、N-ras、K-ras 基因電泳結(jié)果

2.4 瘢痕癌中3種蛋白表達(dá)的相關(guān)性 瘢痕癌中H-ras、N-ras、K-ras蛋白陽(yáng)性率分別為70%、70%、85%，經(jīng)相關(guān)性分析，H-ras與K-ras表達(dá)無(wú)相關(guān)性(r=0.031，P=1.000)， K-ras與N-ras表達(dá)無(wú)相關(guān)性(r=0.336，P=0.202)，H-ras與N-ras表達(dá)無(wú)相關(guān)性(r=0.286，P=0.303)。

3 討論

3.1 瘢痕癌中Ras蛋白的表達(dá)及意義 自Ras基因發(fā)現(xiàn)以來(lái)，其與皮膚腫瘤的研究包括有皮膚基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌和黑色素瘤等，Platz 等【5】研究30例轉(zhuǎn)移性黑色素瘤，發(fā)現(xiàn)23例(76.7%)存在N-ras蛋白的高表達(dá)，研究者們認(rèn)為Ras的高表達(dá)可能與皮膚惡性黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。Kikuchi等【6】應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法研究了皮膚基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌，發(fā)現(xiàn)Ras的表達(dá)與腫瘤分化程度相一致，認(rèn)為Ras的表達(dá)與腫瘤的分化有相關(guān)性。Tanikawa等【7】也報(bào)道，RAS蛋白在脂溢性角化病和Bowen病中分別呈陰性和陽(yáng)性表達(dá)，在惡性黑色素瘤中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。本組用免疫組織化學(xué)和激光掃描共聚焦顯微技術(shù)兩種不同的方法，檢測(cè)了RAS 基因家族3種蛋白在瘢痕癌中的表達(dá)，結(jié)果顯示3種蛋白在瘢痕癌組織中均呈強(qiáng)陽(yáng)性、高表達(dá)，其表達(dá)水平、表達(dá)強(qiáng)度明顯高于正常皮膚表皮和瘢痕上皮(P﹤0.05)，提示三種蛋白的高表達(dá)與瘢痕癌的發(fā)生有密切相關(guān)性。經(jīng)相關(guān)性分析，H-ras、N-ras、K-ras蛋白之間兩兩比較均無(wú)相關(guān)性(P﹥0.05)，提示在瘢痕癌的形成過(guò)程中，Ras基因家族的3種蛋白可能發(fā)揮了協(xié)同作用。作用機(jī)制可能系原癌基因Ras被激活后變成有致癌活性的癌基因，通過(guò)Raf/MEK/ERK途徑促使細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，通過(guò)PI3K/PTEN/Akt介導(dǎo)抗凋亡，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖和癌變，介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生【4.8】。

3.2 瘢痕癌中Ras 基因的突變及意義 Ras基因點(diǎn)突變?cè)谌祟悙盒阅[瘤中約占30%，K-ras、N-ras、H-ras的點(diǎn)突變率分別為85%、15%和﹤1%【9.10】；12、13、61位密碼子為常見(jiàn)的突變位點(diǎn)，尤以第12位密碼子突變最常見(jiàn)，多為GGT突變成GTT【11】。Shields等【12】報(bào)道在胰腺癌中K-ras基因第12位密碼子突變率高達(dá)95%，認(rèn)為該密碼子突變是胰腺癌的早期事件，是早期基因診斷胰腺癌的有效方法。還有報(bào)道，H-ras基因第12位密碼子的突變與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展有相關(guān)性，突變率為46.7%。K-ras基因突變與異位的子宮內(nèi)膜上皮惡變可能有相關(guān)性。在人體皮膚腫瘤的研究中，Ras基因的總突變率在10～20%左右【13】，其中N-ras突變率為16%～22%，而K-ras和H-ras的突變率分別為2%、1%【14】。這些研究結(jié)果提示，人類皮膚腫瘤中Ras基因突變率比其它上皮性腫瘤突變率似乎較低。本組檢測(cè)的14例瘢痕癌組織，未發(fā)現(xiàn)12、13位密碼子的突變。提示 Ras基因家族蛋白的激活可能還有其它方式，或者突變于其它位點(diǎn)，有待進(jìn)一步探討。

3.3 Ras蛋白的表達(dá)及基因突變與病理性瘢痕癌變的相關(guān)性 病理性瘢痕屬于一種癌前病變。癌前病變發(fā)生癌變的潛伏期長(zhǎng)短難以判斷，癌變的不可預(yù)見(jiàn)性很大。一旦發(fā)生癌變而成為瘢痕癌，可能對(duì)患者造成嚴(yán)重的后果。如何早期發(fā)現(xiàn)病理性瘢痕的發(fā)展趨勢(shì)，這是一個(gè)值得重視和探索的問(wèn)題。近年來(lái)，皮膚腫瘤的發(fā)生率有逐年上升趨勢(shì)，這其中不排除某些皮膚腫瘤的發(fā)生是從癌前病變開始慢慢演化而成的。Braut等【15】認(rèn)為，Ras基因的異常表達(dá)是癌變過(guò)程中較早出現(xiàn)的分子改變，與腫瘤的啟動(dòng)及癌變程度密切相關(guān)，對(duì)癌癥的早期發(fā)現(xiàn)具有重要意義。Nindl【16】等報(bào)道在光化性角化病(AK)中有H-ras和P53基因突變，Zaravinos【17】等在同樣的病變中發(fā)現(xiàn)有H-ras的12位密碼子第2堿基G>T置換。研究者認(rèn)為在非腫瘤性病變進(jìn)展惡變的過(guò)程中，基因突變可能是一個(gè)早期事件。本組采用兩種不同的檢測(cè)手段，均顯示3中蛋白在病理性瘢痕上皮組織中呈現(xiàn)低表達(dá)，其表達(dá)水平、表達(dá)強(qiáng)度明顯低于瘢痕癌，與正常皮膚表皮比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示在本組研究的病理性瘢痕組織中沒(méi)有Ras基因三種蛋白的異常表達(dá)。同樣，對(duì)14例瘢痕組織進(jìn)行基因突變檢測(cè)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)12、13位密碼子有突變。

綜上所述，本研究結(jié)果認(rèn)為：Ras基因家族中的3種蛋白在瘢痕癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，與瘢痕癌的發(fā)生有相關(guān)性；在病理性瘢痕和瘢痕癌中未發(fā)現(xiàn)12、13位密碼子突變；病理性瘢痕上皮中3種蛋白的表達(dá)與正常皮膚表皮的表達(dá)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。后兩個(gè)結(jié)果均提示，病理性瘢痕上皮中沒(méi)有癌變?cè)缙谛盘?hào)，這不同于他人的研究，這與受檢標(biāo)本量有關(guān)？與RAS基因在不同來(lái)源腫瘤組織中的激活形式和突變位點(diǎn)有特異性？還是瘢痕和瘢痕癌中可能根本不存在基因突變？這些都留給我們更多的思考，有待進(jìn)一步深入探討。

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CorrelationofRasgeneproteinexpressionandgenemutationandskinpathologicalscarandscarcarcinoma

Guoruizhen,Wanghaiqing,Huchengjiu,Bianke

(Department of Pathology,the Zhuhai Campus of Zunyi Medical College,Guangdong Zhuhai 519041,China)

ObjectiveTo investigate the correlation of Ras family (H-ras/N-ras/K-ras) protein expression and gene mutation between the canceration of skin pathological scar and the occurrence of scar carcinoma abuote.MethodsConfocal microscopy was used to detect the protein expression of K-ras,H-ras and N-ras in skin pathological scars and scar carcinoma tissues.K-ras,H-ras and N-ras expressions in normal skin tissue,pathological scar and scar carcinoma were measured by the immunohistochemical staining of SP method.DNA in skin pathological scar and scar carcinoma tissues was extracted and H-ras,N-ras and K-ras mutations in codons 12 and 13 were analyzed using PCR and sequencing.ResultsThe fluorescence expression of K-ras,H-ras and N-ras in scar carcinoma was higher than those in pathological scar epithelium via confocal microscopy assay.K-ras,H-ras and N-ras protin expression in normal skin tissue,pathological scar epithelium and scar carcinoma was gradually increased.Furthermore,there was significant difference of protein expression level including protein-positive area and the mean optical density between normal skin and scar carcinoma groups (P<0.05).However,no significant difference was shown between normal and skin pathological scar groups (P>0.05).In addition,the mutations of codons 12 and 13 of H-ras,N-ras and K-ras genes were not detected in skin pathological scar and scar carcinoma.Conclusion①The higher expression of K-ras,H-ras and N-ras might play an important role in the occurrence of skin scar carcinoma.②No mutations of codons 12 and 13 of H-ras,N-ras and K-ras genes were found in skin pathological scar and scar carcinoma.③Early canceration signal was not discerned in the pathological scar epithelium.

pathological scar;scar carcinoma;Ras gene;mutation;canceration

遵義醫(yī)學(xué)院自然科學(xué)類招標(biāo)項(xiàng)目(NO:F-552)；貴州省科技攻關(guān)項(xiàng)目(NO:2010-3080)。

R739.5

A

1000-2715(2012)05-0389-07

【收稿2012-06-27；修回2012-09-03】

(編輯：譚秀榮)