酵母雙雜交技術(shù)鑒定FAT10新的結(jié)合蛋白:eEF1A1*

余 新， 劉天德， 袁榮發(fā)， 王慶諾， 李國(guó)惠， 邵江華

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽外科，江西南昌330006)

泛素(ubiquitin)是在真核生物中普遍存在且具有很高保守性的一種蛋白質(zhì)［1］。泛素在調(diào)節(jié)細(xì)胞多種生物學(xué)過(guò)程如細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、基因轉(zhuǎn)錄等過(guò)程中起著重要作用，它的功能異常會(huì)導(dǎo)致包括肝癌等惡性腫瘤的發(fā)生［2－4］。近年來(lái)隨著對(duì)泛素的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)真核細(xì)胞中也廣泛存在著一些同泛素有著部分相同序列或者功能相近的蛋白，同樣發(fā)揮著轉(zhuǎn)錄后的修飾作用，這一類蛋白被稱為類泛素家族，類泛素家族主要分為兩類:即類泛素調(diào)節(jié)子(ubiquitin－like modifiers，UBLs)和泛素結(jié)構(gòu)域蛋白(ubiquitin－domain proteins，UDPs)。UBLs具有同泛素相同的作用特性和功能，研究也證實(shí)類泛素化修飾通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期及Wnt信號(hào)等在肝癌等惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中同樣起著重要作用［5－7］。

FAT10(HLA－F adjacent transcript 10)蛋白屬于UBLs蛋白家族，最早是為了鑒別HLA－F基因定位表達(dá)而被發(fā)現(xiàn)［8］。它是一種由165氨基酸殘基組成的18 kD蛋白，由兩個(gè)泛素樣部分前后融合而成。它的N端有29%與泛素相同，而C端有36%相同。同泛素一樣，F(xiàn)AT10在C端同樣有甘氨酸－甘氨酸殘基。另外，在每個(gè)組成部分中有保守的賴氨酸殘基，類似于泛素的48位賴氨酸殘基，被認(rèn)為是形成多泛素的位點(diǎn)。FAT10屬于泛素相關(guān)蛋白，參與各種基本的細(xì)胞發(fā)展，包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白易位和細(xì)胞周期調(diào)控。Hipp等［9］在研究FAT10作用機(jī)制中發(fā)現(xiàn)FAT10同泛素一樣，通過(guò)標(biāo)記底物而被特異性識(shí)別，最后被降解，但又不同于泛素的作用通路。

目前泛素/類泛素系統(tǒng)功能異常在惡性腫瘤形成中的作用日益被研究者們所重視，而類泛素的研究才剛剛開(kāi)始。類泛素蛋白FAT10在近年來(lái)的研究中被充分證明在惡性腫瘤的形成或發(fā)展中起著重要作用，國(guó)外目前對(duì)于FAT10作用機(jī)制的研究主要局限在其調(diào)節(jié)有絲分裂阻滯缺陷蛋白2(mitotic arrest－deficient protein 2，MAD2)功能作用方面［10］，對(duì)于FAT10在惡性腫瘤形成中的具體作用途徑仍然不清。在本研究中，我們選用FAT10蛋白高表達(dá)的肝癌細(xì)胞株 Hep3B［11］，構(gòu)建 Hep3B細(xì)胞的 cDNA文庫(kù)，然后利用酵母雙雜交技術(shù)，以FAT10基因作為“誘餌”，以肝癌細(xì)胞株 Hep3B的cDNA文庫(kù)作為“獵物”，篩選出FAT10作用通路蛋白和同F(xiàn)AT10作用的底物蛋白并分析FAT10對(duì)作用蛋白的調(diào)控作用。

本文選用 Clontech公司的 Matchmaker GAL4 yeast two－h(huán)ybrid system 3，誘餌基因構(gòu)建在 pGBKT7載體中以與GAL4 DNA－binding domain(DNA－BD)融合形式表達(dá)，而cDNA文庫(kù)構(gòu)建在pGADT7載體中以與GAL4 activating domain(AD)融合形式表達(dá)。若誘餌和文庫(kù)融合蛋白發(fā)生相互作用，分別存在這2種蛋白中的DNA－BD和AD相互靠近，從而激活報(bào)告基因ADE2、HIS3和MEL1(或lacZ)的轉(zhuǎn)錄。因?yàn)檫@些報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是特殊設(shè)計(jì)的，由GAL4 upstream activating sequences(UASs)和TATA boxes控制，而誘餌融合蛋白中的DNA－BD可與其中的UASs結(jié)合。報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄成為可通過(guò)營(yíng)養(yǎng)選擇和半乳糖苷酶檢測(cè)檢出目的克隆的基礎(chǔ)。

材料和方法

1材 料

pcDNA－FAT10質(zhì)粒和Hep3B細(xì)胞cDNA文庫(kù)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建完成，Matchmaker GAL4 yeast two－ hybrid system 3購(gòu)自 TaKaRa，protein A/G Plusagarose、FAT10和真核翻譯延伸因子1α1(eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1，eEF1A1)多克隆抗體均購(gòu)自 Santa Cruz，轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000 Reagent購(gòu)自 Invitrogen，Hep3B細(xì)胞和 MHCC97H細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。其它生化試劑和引物合成均購(gòu)自上海生工公司。

2 方法

2．1 構(gòu)建誘餌質(zhì)粒 參照GenBank的FAT10基因(AF123050．1)，采用 Primer 5．0 軟件設(shè)計(jì)特異性引物:上游 5'－CGCGTTACCATGGCTCCCAATGCTTCCTG－3'，下游5'－CCGCTCGAGTCACCCTCCAATACAATAAG －3'，分別在5'端加上 KpnⅠ和 XhoⅠ的酶切位點(diǎn)。采用 Trizol法提取 Hep3B細(xì)胞的總RNA，以總RNA為模板，按照PrimeScript? One Step RT－PCR Kit Ver．2試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得FAT10 cDNA。將目的片段與pMD?18－T Simple Vector載體克隆完成后，用KpnⅠ、XhoⅠ分別雙酶切重組pMD18－FAT10質(zhì)粒及pcDNA5－FRT空載體進(jìn)行重組，獲得pcDNA－FAT10重組質(zhì)粒。測(cè)序鑒定FAT10 cDNA。

pGBKT7－FAT10以pcDNA－FAT10質(zhì)粒為模板，正義鏈5'－CGCGAATTCATGGCTCCCAATGCTTCCTGC－3'，反義鏈 5'－GGCGTCGACTCACCCTCCAATACAATAAGATGC－3'，采用 PCR 方法擴(kuò)增FAT10基因，下劃線區(qū)域分別為Eco RⅠ、Bam HⅠ酶切位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收處理后，Eco RⅠ和SalⅠ雙酶切，并克隆至pGBKT7載體中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α。pGBKT7－FAT10重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定、雙酶切鑒定后本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行序列測(cè)定。

2．2 pGBKT7－FAT10自激活檢測(cè) 將pGBKT7－FAT10、pGADT7共轉(zhuǎn)化入酵母AH109中，并涂布在SD－Leu－Trp培養(yǎng)基平板上。挑選克隆分別劃線在SD－Leu－Trp培養(yǎng)基和SD－Leu－Trp－His培養(yǎng)基平板上(隨機(jī)挑選4組)。如果該誘餌蛋白沒(méi)有自激活活性，則只能在SD－Leu－Trp培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而不能在SD－Leu－Trp－His培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，并且β－半乳糖苷酶活性檢測(cè)呈陰性;而有自激活活性的誘餌蛋白既能在SD－Leu－Trp培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，也能在SD－Leu－Trp－His培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，并且β－半乳糖苷酶活性檢測(cè)呈陽(yáng)性。

2．3 β－半乳糖苷酶活性檢測(cè) 將酵母克隆點(diǎn)于濾紙上，液氮中反復(fù)凍融3次，每次30s，恢復(fù)至室溫后將濾紙放于浸有Z buffer(Na2HPO4·7H2O 16.1 g/L，NaH2PO4·H2O 5.5 g/L，KCl 0.75 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L)、β－巰基乙醇和X－α－Gal(20 g/L)的濾紙上，置于30℃培養(yǎng)箱內(nèi)，直至藍(lán)色出現(xiàn)。8 h之內(nèi)變藍(lán)為陽(yáng)性克隆。

2．4 酵母雙雜交篩選

2．4．1 酵母雙雜交轉(zhuǎn)化方法實(shí)驗(yàn)操作按Clontech說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用PEG－LiAC將誘餌質(zhì)粒pGBKT7－FAT10和Hep3B細(xì)胞的cDNA文庫(kù)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母菌株 AH109。新鮮制備的 AH109感受態(tài)細(xì)胞8 mL、pGBKT7－FAT10 誘餌質(zhì)粒 0．2 mg、Hep3B 細(xì)胞的cDNA文庫(kù)質(zhì)粒0．1 mg、鮭魚(yú)精DNA 20 mg混合后加入1×PEG/LiAc溶液60 mL，經(jīng)漩渦振蕩混勻后30℃孵30 min，加入7．0mL DMSO，充分混勻后水浴42℃熱激15 min，放置冰上2 min，1 000×g離心5 min，菌體重新懸浮于10 mL 1×TE(pH 7.0)，并涂布在4塊SD－Leu－Trp－His－Ade培養(yǎng)基平板上，30℃倒置培養(yǎng)7 d。

2．4．2 陽(yáng)性酵母克隆的鑒定與分析應(yīng)用酵母質(zhì)粒抽提試劑盒抽提陽(yáng)性酵母克隆質(zhì)粒，并將其電轉(zhuǎn)化入E．coli DH5α中，利用氨芐青霉素(Amp)抗性篩選，陽(yáng)性克隆進(jìn)行質(zhì)粒小量抽提試劑盒抽提。PCR擴(kuò)增 GAL4 AD上的插入片段，上游引物5'－TTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGA －3'，下游引物5'－GATGATGAAGATACCCCACCAAACC－3'。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行HaeШ酶切去重復(fù)。然后將含有非重復(fù)片段的克隆送公司進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果在Gen-Bank上進(jìn)行同源性搜索和序列比對(duì)分析，陽(yáng)性克隆進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

2．5 酵母雙雜交測(cè)序陽(yáng)性克隆回轉(zhuǎn)確證檢測(cè) 分別將pGADT7－eEF1A1+pGBKT7和pGADT7－eEF1A1+pGBKT7－FAT10共轉(zhuǎn)化AH109，并分別涂布在SD－Leu－Trp培養(yǎng)基平板上，挑選克隆劃線在SD－Leu－Trp－His－Ade培養(yǎng)基平板上(隨機(jī)挑選3組)，并進(jìn)行β－半乳糖苷酶活性檢測(cè)。

2．6 熒光共定位 Hep3B細(xì)胞培養(yǎng)24～48 h進(jìn)行爬片，4%多聚甲醛固定，0．5%Triton穿孔，10%正常驢血清封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，分別以羊抗FAT10抗體、兔抗eEF1A1抗體和羊抗FAT10抗體+兔抗eEF1A1抗體孵育過(guò)夜，PBS沖洗，以上各組分別用FITC標(biāo)記的驢抗羊IgG和rhodamine標(biāo)記的驢抗兔IgG孵育1 h，PBS沖洗后共聚焦顯微鏡觀察并照相。

2．7 免疫共沉淀 去除細(xì)胞培養(yǎng)液，用冷PBS洗1次。加RIPA，溶解后，轉(zhuǎn)移到EP管中用振蕩混勻，蛋白定量。離心，上清轉(zhuǎn)移到新tube。往上清分別加入FAT10抗體和eEF1A1抗體，4℃旋轉(zhuǎn)混勻過(guò)夜，加入protein A/G Plus－agarose，再混勻1 h后使agarose沉淀，去上清。往agarose加RIPA，振蕩混勻，離心，去上清。重復(fù)4次洗凈。加3%SDS緩沖液20 μL，－20℃保存?zhèn)溆?。按照加入FAT10抗體的沉淀利用eEF1A1抗體進(jìn)行Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)情況，反之，加入eEF1A1抗體的沉淀利用FAT10抗體進(jìn)行Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。

2．8 RNA干擾降低FAT10表達(dá)后觀察eEF1A1的表達(dá)情況 RNA干擾降低FAT10的表達(dá)的操作按照之前發(fā)表的方法進(jìn)行［12］。提取蛋白后通過(guò)Bradford法進(jìn)行蛋白定量，然后按照RNA干擾組、無(wú)意義組、正常組和PBS組上樣進(jìn)行Wester blotting檢測(cè)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 酵母雙雜交方法篩選與FAT10相互作用的蛋白

構(gòu)建的誘餌質(zhì)粒pGBKT7－FAT10經(jīng)PCR、雙酶切鑒定后遞交測(cè)序，結(jié)果表明插入序列和通讀框均正確，見(jiàn)圖1。自激活檢測(cè)確定誘餌無(wú)自激活，篩庫(kù)不需添加3AT，見(jiàn)圖2。將pGBKT7－FAT10誘餌質(zhì)粒和構(gòu)建在pGADT7載體上的人肝癌Hep3B細(xì)胞cDNA文庫(kù)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母AH109中，SD－Leu－Trp－His－Ade培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。5～7 d后，從中挑選100個(gè)長(zhǎng)勢(shì)良好的克隆進(jìn)行β－半乳糖苷酶活性檢測(cè)，得到28個(gè)β－半乳糖苷酶活性陽(yáng)性的克隆，轉(zhuǎn)化效率:28/100×107=2.8×106;同時(shí)對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行三報(bào)告基因表型鑒定，見(jiàn)圖3。

2 FAT10與eEF1A1的回交實(shí)驗(yàn)及作用蛋白的確定

Figure 1．The PCR and enzyme digestion identification of the plasmid pGBKT7．A:Lane 2 was PCR －amplified FAT10(498 bp)．B:the recombined plasmids were cut using Eco R Iand Sal I．A 498 bp fragment was apparent in Lane 5 and Lane6，indicating the recombinant plasmid，pGBKT7/FAT10，was constructed successfully．圖1 誘餌質(zhì)粒pGBKT7－FAT10的PCR和酶切鑒定

Figure 2．The fusion protein which expressed by the bait plasmid pGBKT7－FAT10 has no auto－activation．Lane A:positive control，pGADT7－T+pGBKT7－53;Lane B:negative control，pGADT7 － T+pGBKT7 － Lam;Lane C:pGADT7+pGBKT7－FAT10．圖2 誘餌質(zhì)粒pGBKT7－FAT10表達(dá)的融合蛋白無(wú)自動(dòng)轉(zhuǎn)錄激活作用

為確認(rèn)FAT10與eEF1A1在酵母中的相互作用，我們進(jìn)行了回交實(shí)驗(yàn)確證檢測(cè)，見(jiàn)圖4:在SDLeu－Trp－His－Ade培養(yǎng)基平板中只有陽(yáng)性對(duì)照和pGADT7－目的基因 +pGBKT7－FAT10能生長(zhǎng)，而pGBKT7－FAT10+pGADT7不能生長(zhǎng)。之后再進(jìn)行β－半乳糖苷酶活性檢測(cè)，見(jiàn)圖3:在8 h內(nèi)只有pGBKT7 FAT10+pGADT7－目的基因和pGBKT7－53+pGADT7－T(positive control)菌落顏色變藍(lán)，為β－半乳糖苷酶陽(yáng)性。以上結(jié)果表明誘餌質(zhì)粒pGBKT7－FAT10在酵母中能與目的基因編碼產(chǎn)物相互作用。抽提陽(yáng)性克隆中酵母質(zhì)粒并電轉(zhuǎn)入大腸桿菌 DH5α中，Amp篩選，抽提質(zhì)粒，PCR擴(kuò)增pGADT7中的文庫(kù)插入片段，PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切后的樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，進(jìn)行對(duì)比除去重復(fù)片段，最后將非重復(fù)克隆遞交測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在Gen-Bank上進(jìn)行同源性和序列比對(duì)分析，有一基因eEF1A1(GenBank accession No．NM_001402．5)，編碼蛋白eEF1A1。

3 免疫共沉淀和細(xì)胞內(nèi)共定位進(jìn)一步證實(shí)FAT10和eEF1A1存在相互作用

Figure 3．The yeast two－h(huán)ybrid screen in a Hep3B cDNA library using FAT10 as the bait．A:the transformation rate:from 1 × 107 transformants，28 clones appeared after 5 d;the transformation ratio was 28/100 × 107=2．8 × 106．B:phenotypic identification of three positive clones．a(chǎn):positive control，pGADT7 － T+pGBKT7 －53;b:negative control，pGADT7 － T+pGBKT7－Lam．圖3 以FAT10作為誘餌篩選成人肝癌cDNA文庫(kù)

Figure 4．Backcrosses revealed three positive clones．A:positive control，pGADT7 － T+pGBKT7 －53;B:negative control，pGADT7－T+pGBKT7－Lam;C:the detection of auto－activation，pGADT7+pGBKT7－FAT10．圖4 回交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證陽(yáng)性克隆

免疫共沉淀的結(jié)果顯示:用抗FAT10抗體獲得的免疫復(fù)合物中用Western blotting不僅檢測(cè)到FAT10蛋白還檢測(cè)到 eEF1A1蛋白，反之用抗eEF1A1抗體獲得的免疫復(fù)合物中不僅可檢測(cè)到eEF1A1蛋白還可檢測(cè)到FAT10蛋白，見(jiàn)圖5;而免疫共定位觀察顯示:經(jīng)圖像并合后證明FAT10蛋白和eEF1A1蛋白在細(xì)胞內(nèi)分布的位置是重合的，這些觀察證明FAT10蛋白和eEF1A1蛋白在細(xì)胞內(nèi)可以復(fù)合體形式存在，見(jiàn)圖6。

4 RNA干擾降低FAT10的表達(dá)后觀察eEF1A1的表達(dá)情況

通過(guò)RNA干擾技術(shù)我們降低了FAT10的表達(dá)，可以觀察到FAT10 mRNA表達(dá)下調(diào)，eEF1A1 mRNA表達(dá)隨之下調(diào)，從而表明FAT10對(duì)eEF1A1的mRNA表達(dá)存在影響，見(jiàn)圖7。

通過(guò)RNA干擾技術(shù)我們降低了FAT10的表達(dá)，隨著FAT10蛋白表達(dá)下調(diào)，可以觀察到eEF1A1蛋白表達(dá)也下調(diào)，見(jiàn)圖8，從而表明FAT10對(duì)eEF1A1的蛋白表達(dá)存在影響。但是這種影響是對(duì)mRNA剪切過(guò)程的影響還是對(duì)mRNA轉(zhuǎn)錄過(guò)程的影響，還需要進(jìn)一步研究來(lái)證實(shí)。

Figure 5．The interaction between FAT10 and eEF1A1 confirmed by co－immunoprecipitation．Lane 1:eEF1A1 and FAT10 were detected in the immunoprecipitant，indicating that FAT10 associates with eEF1A1 when a rabbit anti－ eEF1A1 antibody was used as the bait．Lane 2:FAT10 and eEF1A1 were detected in the immunoprecipitant，meaning that eEF1A1 associates with FAT10 when a goat anti－FAT10 antibody was used as the bait．Therefore，the interaction between FAT10 and eEF1A1 was confirmed．Lane 3:negative control(NC)was only incubated with the second antibody．圖5 免疫共沉淀證實(shí)FAT10和eEF1A1存在相互作用

Figure 6．Co－localization of FAT10 and eEF1A1 confirmed by immunostaining and confocal laser scanning microscopy．A:endogenous FAT10 was detected with a monoclonal anti－ FAT10 antibody，and conjuncted to Second antibody with FITC，so the green color was detected．B:endogenous eEF1A1 was detected with a monoclonal anti－ eEF1A1 antibody，and conjuncted to second antibody with rhodamine，so the red color was detected．C:colocalized proteins(yellow － orange color)were detected by superimposing pictures of the same focal sections resulting in merging of the red and green colors．圖6 免疫熒光染色和激光共聚焦顯微鏡證實(shí)FAT10和eEF1A1共定位

Figure 7．FAT10 siRNA down－regulated eEF1A1 mRNA level．The siRNA fragment for FAT10 was transfected into Hep3B(A)and MHCC97H(B)cells and total RNA was extracted for quantitative PCR．ˉx±s．n=6．*P＜0.05 vs other groups．圖7 RNA干擾降低FAT10的表達(dá)后eEF1A1 mRNA的表達(dá)

Figure 8．FAT10 siRNA down－ regulated eEF1A1 protein level．The siRNA fragment for FAT10 was transfected into Hep3B cells(A)and MHCC97H cells(B)．After 48 h，total protein was extracted for Western blotting analysis．圖8 RNA干擾降低FAT10的表達(dá)后eEF1A1蛋白的表達(dá)

討 論

研究表明FAT10能與人MAD2蛋白非共價(jià)結(jié)合［9］，研究者們利用這一特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)FAT10的過(guò)度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致MAD2功能受到抑制，而MAD2蛋白負(fù)責(zé)在有絲分裂時(shí)保持紡錘體的完整性，它的功能受到抑制則引起染色體不穩(wěn)，這正是許多腫瘤發(fā)生的重要特征。Lee等［10］在肝癌、胃癌以及其它類型的腫瘤中發(fā)現(xiàn)FAT10蛋白的表達(dá)要遠(yuǎn)高于其癌旁和正常組織，指出FAT10可能在肝癌等惡性腫瘤的形成中起著重要作用。Canaan等［13］通過(guò)對(duì)FAT10基因缺失小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AT10的缺失會(huì)增加腫瘤凋亡的易感性。Zhang等［14］通過(guò)對(duì)肝癌細(xì)胞的體外研究發(fā)現(xiàn)，在野生型 p53(wild type p53，wtp53)缺失的Hep3B細(xì)胞中FAT10的蛋白表達(dá)量要高于含wtp53的HepG2和KB3－1細(xì)胞中FAT10蛋白的表達(dá)量，當(dāng)在Hep3B細(xì)胞中導(dǎo)入外源性wtp53后會(huì)導(dǎo)致FAT10轉(zhuǎn)錄表達(dá)能力和啟動(dòng)子活性降低;反之，通過(guò)RNA干擾減低wtp53的表達(dá)量，則會(huì)增強(qiáng)FAT10的啟動(dòng)子活性和蛋白表達(dá)。最近還發(fā)現(xiàn)通過(guò)調(diào)節(jié)FAT10的表達(dá)能影響 p53的轉(zhuǎn)錄活性［15］。因此，F(xiàn)AT10在肝癌等惡性腫瘤形成中的作用引起了許多研究者的極大興趣。同時(shí)FAT10參與各種基本的細(xì)胞發(fā)展，包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白易位和細(xì)胞周期調(diào)控。因而研究FAT10的相互作用蛋白對(duì)了解FAT10在腫瘤形成或發(fā)展中的作用十分重要。

在本研究中，我們通過(guò)酵母雙雜交篩選出一個(gè)1 750 bp的cDNA片段，通過(guò)測(cè)序獲知其同eEF1A1有99．9%相符，因而證實(shí)了一個(gè)新的FAT10相互作用蛋白——eEF1A1。為了進(jìn)一步證實(shí) FAT10和eEF1A1存在相互作用，我們利用FAT10和eEF1A1抗體對(duì)Hep3B細(xì)胞總蛋白進(jìn)行純化，然后交叉用eEF1A1和FAT10抗體通過(guò)Western blotting檢測(cè)到eEF1A1和FAT10蛋白的表達(dá)，同時(shí)利用FAT10和eEF1A1對(duì)純化蛋白檢測(cè)也能對(duì)應(yīng)檢測(cè)到蛋白表達(dá)。因而我們推測(cè)FAT10和eEF1A1相互結(jié)合。另外，我們通過(guò)激光共聚焦檢測(cè)FAT10和eEF1A1在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)情況，觀察到兩者均在胞漿內(nèi)表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)當(dāng)FAT10和eEF1A1 2種抗體同時(shí)孵育的情況下，除了觀察到綠色熒光和紅色熒光外，還可以觀察到大量存在的黃色熒光，這是由于FAT10和eEF1A1存在共定位情況，綠色熒光和紅色熒光重疊所致，這也就表明它們之間存在相互作用。綜上所述，我們證實(shí)FAT10和eEF1A1存在相互作用。

eEF1A1屬于G蛋白家族，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中廣泛表達(dá)，主要參與mRNA翻譯。它通過(guò)形成eEF1A1－GTP－aa－tRNA復(fù)合體將aminoacyl－tRNA(aatRNA)轉(zhuǎn)運(yùn)到核糖體上的受體位點(diǎn)［16］。在哺乳動(dòng)物中，eEF1A1除了骨骼肌、心臟和腦外都廣泛表達(dá)。研究證實(shí)eEF1A1在許多腫瘤細(xì)胞中都呈現(xiàn)高表達(dá)［17－21］。eEF1A1的表達(dá)由 p53轉(zhuǎn)錄因子正調(diào)節(jié)，p53正調(diào)節(jié)eEF1A1使微管切斷導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的凋亡。Zhong等［22］發(fā)現(xiàn)肝癌缺失蛋白1(deleted in liver cancer 1 protein，DLC1)同eEF1A1相互作用，使其能夠更容易地定位在actin表達(dá)豐富的區(qū)域，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移，如導(dǎo)致乳腺癌的轉(zhuǎn)移增加;另外，Zhang等［23］發(fā)現(xiàn) eEF1A1通過(guò)調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞株 HepG2和Hep3B中骨橋蛋白半衰期，影響肝癌細(xì)胞的遷移。Grassi等［24］觀察到eEF1A的2種變體 eEF1A1/2在不同的肝癌細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，而且這種高表達(dá)是同肝癌細(xì)胞的高增殖有關(guān)的。eEF1A在細(xì)胞內(nèi)堿性的環(huán)境下會(huì)誘發(fā)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。這些研究已表明eEF1A1在調(diào)控腫瘤細(xì)胞各種生物學(xué)特性等方面有著重要作用，然而其具體的調(diào)控通路需要進(jìn)一步研究。

在進(jìn)一步的研究中還觀察到在通過(guò)RNA干擾降低FAT10的表達(dá)后同時(shí)伴隨著eEF1A1的表達(dá)降低，這進(jìn)一步證實(shí)了FAT10和eEF1A1之間存在調(diào)控關(guān)系。但是這種影響是對(duì)mRNA剪切過(guò)程的影響還是對(duì)mRNA轉(zhuǎn)錄過(guò)程的影響，還需要進(jìn)一步研究來(lái)證實(shí)。Hipp等［9］在研究FAT10作用機(jī)制中發(fā)現(xiàn)FAT10同泛素一樣，通過(guò)標(biāo)記底物而被特異性識(shí)別，最后被降解，但又不同于泛素的作用通路。FAT10介導(dǎo)的蛋白酶體的靶向作用不依賴泛素連接系統(tǒng)。FAT10是UBLs家族中第一個(gè)像泛素一樣，通過(guò)26S蛋白酶體途徑，與靶向蛋白結(jié)合并使之降解的蛋白。然而eEF1A1也被認(rèn)為是泛素化降解過(guò)程中的必要調(diào)節(jié)途徑之一。首先，eEF1A1通過(guò)和折疊錯(cuò)誤的蛋白結(jié)合而并不是糾正這種折疊錯(cuò)誤，然后通過(guò)蛋白酶體識(shí)別后對(duì)錯(cuò)誤折疊的蛋白進(jìn)行降解，從而精確控制翻譯過(guò)程［25］。其次，eEF1A1通過(guò)與26S蛋白酶體調(diào)控單元Rpt1直接結(jié)合對(duì)翻譯損傷的蛋白識(shí)別，并讓其同蛋白酶體接近而被降解［26］。Koiwai等［27］的研究表明BPOZ－2(Bood POZ containing gene type 2)與eEF1A1相互結(jié)合并能夠促使其泛素化及依賴26S蛋白酶體的降解，同時(shí)BPOZ－2抑制GTP和eEF1A1的結(jié)合從而阻止翻譯延伸的過(guò)程。

綜上所述，F(xiàn)AT10可能通過(guò)調(diào)節(jié)eEF1A1的表達(dá)而對(duì)腫瘤細(xì)胞各種生物學(xué)特性發(fā)生影響，然而它們之間具體的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究來(lái)證實(shí)。所以在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，我們將關(guān)注它們之間相互作用的分子機(jī)制，為進(jìn)一步研究FAT10在腫瘤的形成和發(fā)展中發(fā)揮的功能提供更充分的依據(jù)。

［1］ Hochstrasser M．Origin and function of ubiquitin－like proteins［J］．Nature，2009，458(7237):422 －429．

［2］ Hoeller D，Hecker CM，Dikic I．Ubiquitin and ubiquitin－ like proteins in cancer pathogenesis［J］．Nat Rev Cancer，2006，6(10):776 －788．

［3］ Kerscher O，F(xiàn)elberbaum R，Hochstrasser M．Modification of proteins by ubiquitin and ubiquitin － like proteins［J］．Annu Rev Cell Dev Biol，2006，22:159 －180．

［4］ Kirkin V，Dikic I．Role of ubiquitin － and Ubl－ binding proteins in cell signaling［J］．Curr Opin Cell Biol，2007，19(2):199－205．

［5］ Wu F，Mo Y．Ubiquitin － like protein modifications in prostate and breast cancer［J］．Front Biosci，2007，12:700 －711．

［6］ Yam JW，Wong CM，Ng IO．Molecular and functional genetics of hepatocellular carcinoma［J］．Front Biosci(Schol Ed)，2010，2:117 －134．

［7］ Wei W，Chua MS，Grepper S，et al．Blockade of Wnt－1 signaling leads to anti－tumor effects in hepatocellular carcinoma cells［J］．Mol Cancer，2009，8:76．

［8］ Fan W，Cai W，Parimoo S，et al．Identification of seven new human MHCclass I region genes around the HLA－F locus［J］．Immunogenetics，1996，44(2):97 －103．

［9］ Hipp MS，Kalveram B，Raasi S，et al．FAT10，a ubiquitin － independent signal for proteasomal degradation［J］．Mol Cell Biol，2005，25(9):3483 －3491．

［10］ Liu YC，Pan J，Zhang C，et al．A MHC － encoded ubiquitin－like protein(FAT10)binds noncovalently to the spindle assembly checkpoint protein MAD2［J］．Proc Natl Acad U SA，1999，96(8):4313 －4318．

［11］ Lee CG，Ren J，Cheong IS，et al．Expression of the FAT10 gene is highly upregulated in hepatocellular carcinoma and other gastrointestinal and gynecological cancers［J］．Oncogene，2003，22(17):2592－2603．

［12］ 劉天德，余 新，洪 波，等．siRNA對(duì)肝癌細(xì)胞異常表達(dá)FAT10基因的抑制效應(yīng)研究［J］．新醫(yī)學(xué)，2009，40(6):358 －360，417．

［13］ Canaan A，Yu X，Booth CJ，et al．FAT10/diubiquitin － like protein－deficient mice exhibit minimal phenotypic differences［J］．Mol Cell Biol，2006，26(13):5180 －5189．

［14］ Zhang DW，Jeang KT，Lee CG．p53 negatively regulates the expression of FAT10，a gene upregulated in various cancers［J］．Oncogene，2006，25(16):2318 －2327．

［15］ Li T，Santockyte R，Yu S，et al．FAT10 modifies p53 and upregulates its transcriptional activity［J］．Arch Biochem Biophys，2011，509(2):164 －169．

［16］ Knudsen SM，F(xiàn)rydenberg J，Clark BF，et al．Tissuedependent variation in the expression of elongation factor－1α isoforms:isolation and characterisation of a cDNA encoding a novel variant of human elongation－factor 1α［J］．Eur JBiochem，1993，215(3):549－554．

［17］ Johnsson A，Zeelenberg I，Min Y，et al．Identification of genes differentially expressed in association with acquired cisplatin resistance［J］．Br J Cancer，2000，83(8):1047－1054．

［18］ Grant AG，F(xiàn)lomen RM，Tizard ML，et al．Differential screening of a human pancreatic adenocarcinomaλgt11 expression library has identified increased transcription of elongation factor EF －1α in tumour cells［J］．Int J Cancer，1992，50(5):740 －745．

［19］ Zhang L，Zhou W，Velculescu VE，et al．Gene expression profiles in normal and cancer cells［J］．Science，1997，276(8):1268 －1272．

［20］ Xie D，Jauch A，Miller CW，et al．Discovery of overexpressed genes and genetic alterations in breast cancer cells using a combination of suppression subtractive hybridization，multiplex FISH and comparative genomic hybridization［J］．Int J Oncol，2002，21(3):499 －507．

［21］ Mohler JL，Morris TL，F(xiàn)ord OH 3rd，et al．Identification of differentially expressed genes associated with androgen－ independent growth of prostate cancer［J］．Prostate，2002，51(4):247 －255．

［22］ Zhong D，Zhang J，Yang S，et al．The SAM domain of the RhoGAP DLC1 binds EF1A1 to regulate cell migration［J］．JCell Sci，2009，122(Pt 3):414 －424．

［23］ Zhang J，Guo H，Mi Z，et al．eEF1A1 － actin interactions alter mRNA stability to determine differential osteopontin expression in HepG2 and Hep3B cells［J］．Exp Cell Res，2009，315(2):304 －312．

［24］ Grassi G，Scaggiante B，F(xiàn)arra R，et al．The expression levels of the translational factors eEF1A 1/2 correlate with cell growth but not apoptosis in hepatocellular carcinoma cell lines with different differentiation grade［J］．Biochimie，2007，89(12):1544 －1552．

［25］ Hotokezaka Y，Tobben U，Hotokezaka H，et al．Interaction of the eukaryotic elongation factor 1A with newly synthesized polypeptides［J］．J Biol Chem，2002，277(21):18545－18551．

［26］ Chuang SM，Chen L，Lambertson D，et al．Proteasomemediated degradation of cotranslationally damaged proteins involves translation elongation factor 1A［J］．Mol Cell Biol，2005，25(1):403 －413．

［27］ Koiwai K，Maezawa S，Hayano T，et al．BPOZ－2 directly binds to eEF1A1 to promote eEF1A1 ubiquitylation and degradation and prevent translation［J］．Genes Cells，2008，13(6):593－607．