siRNA抑制PPARγ表達(dá)對(duì)絨癌細(xì)胞JEG－3侵襲力的影響

許 華， 陳麗君

滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)是人類胎盤及胚胎發(fā)育的關(guān)鍵過(guò)程，其結(jié)果為胚胎植入母體組織，間質(zhì)成分以及母胎間血管浸潤(rùn)。母體螺旋動(dòng)脈周圍血管平滑肌的退化以及內(nèi)皮細(xì)胞被滋養(yǎng)細(xì)胞取代，最終可導(dǎo)致血管腔的擴(kuò)張，增加絨毛間血流供應(yīng)［1－2］。妊娠期母兒間特殊的血管聯(lián)系，使胎兒從母體中得到了持續(xù)的養(yǎng)分及血氧供應(yīng)。滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力不足與各種不同的病理妊娠有關(guān)。底蛻膜的淺浸潤(rùn)以及螺旋動(dòng)脈重鑄受阻，可導(dǎo)致子癇前期、胎兒生長(zhǎng)受限及自然流產(chǎn)等病理妊娠的發(fā)生［3－5］。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator－activated receptor gamma，PPARγ)屬配體依賴的核激素受體超家族成員，廣泛存在于各種組織中，PPARγ處于多種信號(hào)轉(zhuǎn)錄途徑的交叉點(diǎn)，被配體激活后在轉(zhuǎn)錄水平上抑制多種細(xì)胞的增殖、侵襲、分化和凋亡，在滋養(yǎng)細(xì)胞中廣泛存在［6］，由于JEG－3細(xì)胞株的生物學(xué)特性與細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞(cytotrophoblasts)的特性非常相似，本實(shí)驗(yàn)將PPARγsiRNA轉(zhuǎn)染JEG－3細(xì)胞，觀察其對(duì)JEG－3細(xì)胞侵襲能力的影響，從而探討子癇前期、胎兒生長(zhǎng)受限及習(xí)慣性流產(chǎn)等病理妊娠的發(fā)病機(jī)制。

材料和方法

1 主要試劑

人絨毛膜上皮癌細(xì)胞JEG－3購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)院。RPMI－1640培養(yǎng)液(HyClone)，胎牛血清(上海復(fù)蒙)，siRNA(廣州銳博生物)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)，SYBR Premix TaqTM(GeneCopoeia)，Trizol(TaKaRa)，Transwell小室(膜孔徑 8μm)(Costar)，Matrigel基質(zhì)膠(BD)，轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000(Invitrogen)，其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 主要方法

2．1 細(xì)胞培養(yǎng) JEG－3細(xì)胞采用含有10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于溫度37℃、濕度95%、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞經(jīng)0．25%含EDTA胰酶消化后，以5×105cells/well的密度接種于6孔板中，用于轉(zhuǎn)染及測(cè)定轉(zhuǎn)染效率，提取細(xì)胞中mRNA以及觀察細(xì)胞的侵襲能力。

2．2 siRNA的合成與轉(zhuǎn)染 根據(jù) GenBank中PPARγ的序列號(hào)，由廣州銳博生物技術(shù)公司設(shè)計(jì)合成siRNA，產(chǎn)品為3條對(duì) PPARγ高效沉默的雙鏈siRNA，序列分別為:S1正義鏈5'－AGAUAAAGCUUCUGGAUUUdTdT －3'，反義鏈 3'－ dTdTUCUAUUUCGAAGACCUAAA－5'，其針對(duì)靶序列為 AGATAAAGCTTCTGGATTT;S2正義鏈5'－AGGAAAGACAACAGACAAAdTdT－3'，反義鏈 3'－dTdTUCCUUUCUGUUGUCUGUUU－5'，其針對(duì)靶序列為 AGGAAAGCAAA;S3正義鏈5'－GUACCAAAGUGCAAUCAAAdTdT －3'，反義鏈 3'－ dTdTCAUGGUUUCACGUUAGUUU－5'，的針對(duì)靶序列為 GTACCAAAGTGCAATCAAA。非特異性陰性對(duì)照(negative control)siRNA的序列不靶向沉默人類目前已知的任何基因，并且與PPARγ基因不具有同源性。帶有熒光標(biāo)記的siRNA用于檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，本實(shí)驗(yàn)中的陰性對(duì)照siRNA帶有熒光標(biāo)記Cy3，最大發(fā)射波長(zhǎng)為570 nm，熒光顯微鏡下觀察綠色光下發(fā)紅光。siRNA產(chǎn)品按說(shuō)明書用滅菌ddH2O配制成20μmol/L溶液，分裝保存于－20℃中。常規(guī)培養(yǎng)JEG－3細(xì)胞后，將細(xì)胞按5×105cells/well密度接種至6孔板中，培養(yǎng)箱中孵育約24 h后，細(xì)胞生長(zhǎng)融合度約為30% ～50%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。具體步驟按提供的說(shuō)明書進(jìn)行。

2．3 電子熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率 根據(jù)推薦濃度，分別以100、50 nmol/L的終濃度將帶有熒光標(biāo)記的陰性對(duì)照siRNA(濃度過(guò)低轉(zhuǎn)染效率可能會(huì)低，濃度過(guò)高可能產(chǎn)生脫靶效應(yīng)及增加細(xì)胞毒性)，2μL Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染6孔板中的JEG－3細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后6 h置于電子熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。經(jīng)過(guò)觀察，以終濃度為100 nmol/L時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染效率最高，備下面繼續(xù)研究。

2．4 實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)PPARγ及黏蛋白－1(mucin－1，MUC1)mRNA的表達(dá) 廣州銳博生物技術(shù)公司提供的PPARγ特異性siRNA共有3條鏈:S1、S2及S3，為測(cè)定這3條鏈對(duì)PPARγ基因的抑制率，設(shè)實(shí)驗(yàn)(1)為S1組(轉(zhuǎn)染PPARγ特異性siRNA中的S1鏈)、S2組(轉(zhuǎn)染PPARγ特異性siRNA中的S2鏈)、S3組(轉(zhuǎn)染 PPARγ特異性 siRNA中的 S3鏈)、S4組(轉(zhuǎn)染混勻的PPARγ特異性siRNA中的S1、S2、S3鏈)和陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照 siRNA)。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，轉(zhuǎn)染24 h后提取各組JEG－3細(xì)胞的總RNA，按RT試劑盒說(shuō)明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)PPARγmRNA，引物由廣州復(fù)能基因有限公司設(shè)計(jì)合成，PPARγ的引物序列為上游5'－GAACAGATCCAGTAATTGCAG －3'，下游5'－AGGCTCTTCATGAGGCTTATTG －3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度為137 bp;管家基因β－actin引物序列為:上游5'－ CCAACCGCGAGAAGATGA －3'，下游 5'－CCAGAGGCGTACAGGGATAG －3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為97 bp。反應(yīng)體系總體積25μL，在LightCycler 2．0 real－time PCR擴(kuò)增儀上擴(kuò)增，退火溫度50℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。采用2－ΔΔCt相對(duì)定量法計(jì)算各組PPARγ表達(dá)量與β－actin表達(dá)量的比值，置空白對(duì)照組的值為1，換算出各組PPARγmRNA的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。實(shí)驗(yàn)證明，S2鏈siRNA對(duì)PPARγ的抑制效率最高，用于實(shí)驗(yàn)組，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

另設(shè)實(shí)驗(yàn)(2)為實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染PPARγsiRNA)、陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA)和空白對(duì)照組(不轉(zhuǎn)染任何siRNA，余試劑與其它2組相同)，每組設(shè)3復(fù)孔，檢測(cè)PPARγ及MUC1 mRNA的表達(dá)。MUC1引物序列:上游5'－GGAAGACCCAGCACT－3'，下游5'－CACAGATCC TGGCCTGAAC －3'，按上述步驟進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。

2．5 Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的侵襲能力

取30μL按1∶5稀釋的Matrigel基質(zhì)膠包被Transwell小室(8μm孔徑)的上面，37℃培養(yǎng)箱中放置4 h。將轉(zhuǎn)染后24 h的各組細(xì)胞收集后，分別用含10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)至4×105/L，取100μL細(xì)胞懸液加入小室的上室，另將600μL含20%胎牛血清的 RPMI－1640培養(yǎng)液加入小室的下室，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h取出Transwell小室，用棉簽小心拭去濾膜上室面的細(xì)胞，常規(guī)HE染色，取下濾膜，粘于載玻片上，于倒置顯微鏡的高倍顯微鏡(×400)下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)并取其平均值，以穿膜細(xì)胞數(shù)表示細(xì)胞的侵襲能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取其平均值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示。組間差異用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 JEG－3細(xì)胞的siRNA的轉(zhuǎn)染效率

熒光標(biāo)記siRNA波長(zhǎng)為470 nm，在綠色光下發(fā)紅色熒光，以100 nmol/L的siRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染，其轉(zhuǎn)染效率最高，見(jiàn)圖1。

Figure 1．Results of JEG－3 cells transfected by siRNA labelled by fluorescence after 6 h by fluorescence microscopy( ×400)．A:the final concentration of siRNA was 100 nmol/L;B:the final concentration of siRNA was 50 nmol/L．圖1 熒光顯微鏡下觀察熒光標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染JEG－3細(xì)胞6 h

2 各組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中PPARγ及MUC1 mRNA的表達(dá)情況

轉(zhuǎn)染PPARγsiRNA后，S1組與空白對(duì)照組相比，PPARγmRNA 的表達(dá)水平下調(diào)了(40．88±1．05)%(P＜0.05)，S2組與空白對(duì)照組相比，下調(diào)了(71．92±0．71)%(P ＜0.05)，S3 組與空白對(duì)照組相比，下調(diào)了(62．69±0．66)%(P ＜0.05)，S4組與空白對(duì)照組相比，下調(diào)了(52．80±0．52)%(P＜0.05)。其中，S2組siRNA抑制效率最高，見(jiàn)圖2。

Figure 2．Relative expression of PPARγmRNA in JEG－3 cells after transfection．ˉx±s．n=15．*P＜0.05 vs negative control．圖2 實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后PPARγmRNA的相對(duì)表達(dá)量

轉(zhuǎn)染PPARγsiRNA后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中 PPARγ mRNA的表達(dá)水平與空白對(duì)照組相比下調(diào)了(75．0±0．8)%(P＜0.05)，陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組則無(wú)顯著差異(P＞0.05)，見(jiàn)圖3。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中MUC1 mRNA的表達(dá)水平與空白組相比下調(diào)了(65．0±1．3)%(P＜0.05)，陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組則無(wú)顯著差異(P＞0.05)，見(jiàn)圖4。

Figure 3．Relative expression of PPARγmRNA in JEG－3 cells after transfection．ˉx±s．n=9．*P＜0.05 vs other groups．圖3 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后PPARγmRNA相對(duì)表達(dá)量

Figure 4．Relative expression of MUC1 mRNA in JEG－3 cells after transfection．ˉx±s．n=9．*P＜0.05 vs other groups．圖4 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后MUC1 mRNA相對(duì)表達(dá)量

3 各組轉(zhuǎn)染后JEG－3細(xì)胞侵襲力的比較

高倍顯微鏡(×400)下，實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)為(47±4)個(gè)，陰性對(duì)照組的穿膜細(xì)胞數(shù)為(25±3)個(gè)，空白對(duì)照組的穿膜細(xì)胞數(shù)為(23±3)個(gè)，實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)與空白對(duì)照組的穿膜細(xì)胞數(shù)有顯著差異(P＜0.05)，說(shuō)明轉(zhuǎn)染PPARγsiRNA后，細(xì)胞的侵襲力增強(qiáng)。陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組的穿膜細(xì)胞數(shù)相比無(wú)顯著差異(P ＜0.05)，見(jiàn)圖5、6。

Figure 5．The invasion of JEG －3 cells24 h after transfection( ×400)．A:blank control group;B:negative control group;C:experiment group．圖5 轉(zhuǎn)染24 h后各組JEG－3細(xì)胞的侵襲力

Figure 6．The number of JEG－3 cells penetrating membrane 24 h after transfection．ˉx±s．n=9．*P＜0.05 vs other groups．圖6 轉(zhuǎn)染24 h后各組JEG－3細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)

討 論

人類胚胎的著床、胎盤的形成以及胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育與滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、分化及侵襲功能有密切關(guān)系，受一系列復(fù)雜的、彼此聯(lián)系的事件精密、嚴(yán)格地調(diào)控，其中滋養(yǎng)細(xì)胞對(duì)子宮內(nèi)膜的合理侵入，以及著床后滋養(yǎng)細(xì)胞對(duì)子宮蛻膜層和肌層血管的侵襲，使子宮螺旋動(dòng)脈發(fā)生血管重鑄等生理現(xiàn)象，是決定妊娠正常與否的關(guān)鍵，并維持妊娠的正常進(jìn)行。滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力受多種因素調(diào)控［7］:滋養(yǎng)細(xì)胞分泌合成一些細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞的凋亡調(diào)節(jié)血管重鑄過(guò)程、子宮螺旋動(dòng)脈血流動(dòng)力學(xué)、細(xì)胞外基質(zhì)成分的改變、血管平滑肌細(xì)胞特性的變化以及局部免疫環(huán)境的變化。當(dāng)這些因素平衡失調(diào)時(shí)，滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力不足，子宮螺旋動(dòng)脈血管重鑄受阻，可能導(dǎo)致子癇前期、胎兒生長(zhǎng)受限及自然流產(chǎn)的發(fā)生。目前為止，已有許多研究發(fā)現(xiàn)多種影響滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲的因素及其在子癇前期等病理妊娠中的發(fā)病機(jī)制，探討各種因子在滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及其作用已成為目前病理妊娠研究的熱點(diǎn)。

PPARs屬于Ⅱ型核受體超家族成員，是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類核激素受體超家族成員。目前，已發(fā)現(xiàn)3種不同的PPARs亞型，分別為PPARα、PPARβ及PPARγ，這3種亞型在結(jié)構(gòu)及功能上各有差異。其中，PPARγ有6個(gè)區(qū)域(A～F)，4個(gè)功能結(jié)構(gòu)域:N末端的A/B結(jié)構(gòu)區(qū)為非配體依賴性的轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域，可通過(guò)MAPK途徑被磷酸化，影響轉(zhuǎn)錄活性以及配基與受體結(jié)合;DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域C區(qū)與啟動(dòng)子和目的基因結(jié)合，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄;轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域D區(qū)，是阻遏劑結(jié)合位點(diǎn)，許多核內(nèi)因子與該結(jié)構(gòu)域結(jié)合影響PPARγ活性;配體結(jié)合域E區(qū);F為配體依賴性活化區(qū)。PPARγ須依賴于與其配體相結(jié)合，PPARγ被激活后與視磺酸受體(retinoic X receptor，RXR)結(jié)合形成異二聚體，再與過(guò)氧化物酶體增殖物反應(yīng)元件(peroxisome proliferator responsive element，PPRE)結(jié)合，激活靶基因，從而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及各種生物學(xué)效應(yīng)［8－9］。PPARγ 處于各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的交叉點(diǎn)，參與了糖、脂肪代謝、單核細(xì)胞激活、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞的分化、增生及凋亡等生理病理過(guò)程。其生物學(xué)功能復(fù)雜多樣，須與相應(yīng)配體結(jié)合后才能活化，產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。

迄今，已有很多關(guān)于PPARγ與滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力方面的研究。Barak等［10］最早發(fā)現(xiàn)PPARγ在胎盤發(fā)育中的作用，在其研究中發(fā)現(xiàn)PPARγ基因敲除影響了孕鼠胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的終末分化以及胎盤血管發(fā)生變化。Asami－Miyagishi等［11］采用 RT－PCR 方法檢測(cè)到在小鼠孕11 d時(shí)胎盤中即有PPARγmRNA的表達(dá)，在孕13 d時(shí)表達(dá)升高，之后則表達(dá)下降。免疫組化方法發(fā)現(xiàn)在孕鼠胎盤的母胎界面有PPARγ及其天然配體15－d－PGJ2的表達(dá)，說(shuō)明PPARγ參與了胎盤的發(fā)育、發(fā)展過(guò)程。Fournier等［12］通過(guò)建立體外滋養(yǎng)細(xì)胞模型，用PPARγ的激活物抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲力，并且檢測(cè)到轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factorβ，TGF－β)和妊娠相關(guān)血漿蛋白A(pregnancy－associated plasma protein－A，PAPP－A)的下調(diào)及白細(xì)胞介素－1β(interleukin－1β，IL－1β)的上調(diào)，因?yàn)檫@些因子可能與滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲有關(guān)，推測(cè)PPARγ可能通過(guò)以上途徑影響滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力。李淑娟等［13］利用早孕絨毛分離培養(yǎng)絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)PPARγ的上調(diào)抑制了基質(zhì)金屬蛋白酶2、9(matrix metalloproteinase－2，9，MMP－2和 MMP－9)的表達(dá)，PPARγ抑制滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力可能與MMP－2、9有關(guān)。這些研究都表明PPARγ通過(guò)不同途徑影響滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力。Shalom－Barak等［14］通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究顯示MUC1基因是 PPARγ的靶基因，PPARγ缺失的胎盤組織中MUC1的表達(dá)也缺失，PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮(rosiglitazone)可上調(diào)MUC1基因的表達(dá)，推斷PPARγ可能通過(guò)調(diào)節(jié)MUC1調(diào)節(jié)胎盤的發(fā)育，另有研究發(fā)現(xiàn)，Shyu等［15］通過(guò)體外培養(yǎng)滋養(yǎng)細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)MUC1的過(guò)表達(dá)能夠下調(diào)MMP－9的表達(dá)，并抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力。

因此本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用siRNA技術(shù)，能夠特異性地抑制JEG－3細(xì)胞中PPARγ的表達(dá)，其mRNA抑制效率達(dá)(75．0±0．8)%，同時(shí)能夠下調(diào)黏蛋白 MUC1 mRNA水平的表達(dá)(65．0±1．3)%。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PPARγ的下調(diào)能夠使滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)，這與之前的研究結(jié)果相一致，通過(guò)體外培養(yǎng)滋養(yǎng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)再一次驗(yàn)證了PPARγ能通過(guò)調(diào)節(jié)MUC1的表達(dá)影響滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力。

目前，國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有關(guān)于通過(guò)抑制PPARγ下調(diào)滋養(yǎng)細(xì)胞中MUC1的表達(dá)影響滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力的研究，本研究驗(yàn)證了這一點(diǎn)。但是PPARγ對(duì)MUC1的具體調(diào)節(jié)機(jī)制目前還不清楚，尚待進(jìn)一步研究。這些研究將為探索滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力不足引起的子癇前期、胎兒生長(zhǎng)受限及自然流產(chǎn)等病理妊娠的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。

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