肝癌Hep3B細胞HLA－G過表達對NK細胞體外殺傷作用的影響*

曾憲成， 張 彤， 李 華， 方天翎， 聶常富， 陳規(guī)劃△

(1增城市人民醫(yī)院普通外科，廣東增城511300;2中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院肝移植中心，廣東廣州510630;3廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝膽外科，廣東廣州510120;4鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽外科，河南鄭州450003)

人類白細胞抗原G(human leukocyte antigen－G，HLA－G)是一種非經(jīng)典的HLA－Ib類抗原，參與保護胚胎免受母體淋巴系統(tǒng)的攻擊。它最早于1987年被 Geraghty等［1］克隆，1990 年 Kovats等［2］發(fā)現(xiàn)它在胎盤絨毛遠端的細胞滋養(yǎng)層特異表達。到目前為止已發(fā)現(xiàn)HLA－G在人類多種惡性腫瘤中表達，HLA－G與腫瘤免疫逃逸的關(guān)系成為關(guān)注的焦點。Wang等［3］發(fā)現(xiàn)肝癌中表達HLA－G，并且其是影響預(yù)后的獨立因素，推測HLA－G可能通過抑制NK細胞，促進肝癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。我們在前期實驗中發(fā)現(xiàn)肝癌細胞系中Hep3B細胞表達HLA－G最少，因此，我們選用Hep3B細胞構(gòu)建HLA－G過表達模型，研究其在體外與NK細胞殺傷作用的關(guān)系。

材料和方法

1 材料

Hep3B細胞購自中科院上海細胞生物研究所，采用含10%FBS高糖DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2、飽和濕度的條件下培養(yǎng)，每3～4 d換液，70%～80%融合后0.25%胰蛋白酶消化傳代。大腸桿菌DH5α由中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院中心實驗室保存。胎牛血清及DMEM高糖培養(yǎng)基均購自Gibco，dNTPs(Promega)，Taq polymerase(TaKaRa)，Plasmid Maxi Kit(Qiagen)，Xho I、Bam H I、Age I、T4 DNA ligase 和T4 DNA ligase buffer(NEB)，Lipofectamine 2000(Invitrogen)，Opti－MEM(Gibco)，RNAprep pure總 RNA提取試劑盒(北京天根)，快速凝膠回收試劑盒(O-mega)，SYBR? PrimeScriptTMRT－PCR Kit(TaKa-Ra)，小鼠抗人HLA－G單克隆抗體和小鼠抗人GAPDH單克隆抗體(Abcam)，小鼠抗人HLA－ABC單克隆抗體(Biolegend)，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的羊抗小鼠抗體(Pierce)。

2 方法

2．1 引物設(shè)計和目的基因擴增 根據(jù)GenBank HLA－G的編碼序列，用Primer Premier 5軟件設(shè)計包括HLA－G全長的引物，HLA－G上游引物5’－TAATAACTCGAGATATGGTGGTCATGGCA－3’，下游引物5’－TAATAAGGATCCCTAATCTGAGCTCTTCTTCC －3’，擴增片段為1 017 bp，引物由上海英駿公司合成。以含有待擴增序列的DNA為模板進行PCR擴增，50μL反應(yīng)總體積中加入下列物質(zhì):H2O 38 μL、10 × Pfx Buffer、10 mmol/L dNTPs 1.5 μL、50 mmol/L MgSO4、Platinum Pfx、10 mmol/L 引物各 1.5 μL，在PCR儀上完成PCR擴增，擴增條件如下:95℃ 預(yù)變性2 min，95 ℃ 15 s，52 ℃ 15 s，68 ℃ 60 s，30個循環(huán)，68℃ 5 min。取3.5μL PCR擴增產(chǎn)物，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以鑒定PCR擴增結(jié)果。

2．2 過表達載體的構(gòu)建及鑒定 將上述DNA片段退火，用T4連接酶連接于經(jīng)雙酶切(Xho I和Bam H I)的質(zhì)粒 pEGFP－C1，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌DH5α，接種到含50 mg/L kanamycin的 LB培養(yǎng)基中。使用堿裂解法抽提質(zhì)粒，所得質(zhì)粒用Xho I和Bam H I分別酶切鑒定。將篩選到的陽性克隆進行測序鑒定。

2．3 細胞培養(yǎng)與篩選 Hep3B細胞37℃、5%CO2培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液中。將處于對數(shù)生長期的細胞接種于12孔板中，至細胞密度達90%時，加入含 G418的培養(yǎng)液1 mL/well(G418終濃度分別為100～800 mg/L)。持續(xù)培養(yǎng)，2周后G418濃度≤200 mg/L各孔細胞穩(wěn)定生長，而≥300 mg/L細胞孔相繼全部死亡。因此，在本實驗條件下G418篩選濃度為400 mg/L，維持濃度為200 mg/L。實驗分為正常對照組(無干預(yù)措施，Hep3B組)、空載體對照組(轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒，Hep3B－GFP組)和實驗組(轉(zhuǎn)染pEGFP－C1－HLA－G質(zhì)粒，Hep3B－HLA－G組)。

2．4 細胞轉(zhuǎn)染與篩選 2×105～3×105Hep3B細胞傳入24孔板，第2 d待細胞密度達70% ～85%以上時，按Lipofectamine 2000操作手冊轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h后細胞用胰酶消化，按每孔50個細胞轉(zhuǎn)移至24孔板。G418的篩選濃度維持2周后，擴大培養(yǎng)。

2．5 Real－time PCR檢測 HLA－G mRNA表達收集上述3組細胞，用PBS洗3次，按照試劑盒操作手冊提取總RNA，用紫外分光光度法定量RNA。將等量的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA第1鏈。SYBR? Pri-meScriptTMRT－PCR Kit(兩步法)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下:37℃ 15 min，85℃ 5 s。將PCR反應(yīng)液加入real－time PCR用反應(yīng)管中:95℃ 10 s，1個循環(huán);95℃5 s，60 ℃ 31 s，40 個循環(huán);95 ℃ 15 s，60 ℃ 10 s，95℃ 15 s，1個循環(huán)。分析熔解曲線和擴增曲線，計算ΔCt值和 RQ 值(RQ=2－ΔΔCt)。

2．6 Western blotting檢測HLA－G蛋白表達 分別收取3組細胞，PBS洗3次，細胞刮將細胞刮下，按照試劑盒操作手冊提取總蛋白。BCA蛋白定量試劑盒對收取的各組蛋白進行定量，取等量蛋白30μg行SDS－PAGE，電泳轉(zhuǎn)移至PVDF膜，脫脂奶粉封閉3 h后加小鼠抗人單抗HLA－G I抗(1∶500)放置于4℃過夜，HRP標記羊抗鼠IgG II抗(1∶100 000)與膜室溫孵育1 h。PVDF膜曝光60～90 s后膠片放入全自動X片沖洗機完成顯影、定影，干燥等。Bio－Rad全自動掃描儀掃描膠片，Quantity One軟件分析結(jié)果。

2．7 細胞毒性檢測 (1)實驗分組為空白組、靶對照組、效應(yīng)對照組、實驗組。(2)實驗組包括未封閉組和封閉組。封閉組:選生長良好的Hep3B、Hep3B－GFP和Hep3B－HLA－G細胞，每瓶均加入小鼠抗人 HLA －ABC 抗體(終濃度5 mg/L)［4］，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。未封閉組:為正常培養(yǎng)Hep3B、Hep3B－GFP和Hep3B－HLA－G細胞，未用小鼠抗人HLA－ABC抗體封閉。外周血單個核細胞的活性檢測法參照孫衛(wèi)民等［5］的方法計數(shù)細胞，調(diào)整靶細胞濃度為1×108/L，效應(yīng)細胞濃度為1×109/L，效靶比(效應(yīng)細胞∶靶細胞)10∶1。每組均各設(shè)3個復(fù)孔。(3)計算方法:殺瘤活性(%)=1－(效應(yīng)組－對照組)/(靶對照組－空白對照組)×100%。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計分析軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(ˉx±s)表示，多個樣本均數(shù)比較應(yīng)用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PCR擴增目的基因

PCR擴增目的基因產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，在約1 017 bp處有一特異性擴增條帶，與預(yù)期的大小片段一致，見圖1。

2 HLA－G過表達質(zhì)粒酶切鑒定

將pEGFP－C1－HLA－G進行雙酶切，回收目的片段，并與表達載體連接。對PCR檢測陽性的克隆抽提質(zhì)粒DNA。PCR產(chǎn)物得到了1 017 bp的目的片段和約4 731 bp的載體片段，結(jié)果表明HLA－G成功地構(gòu)建到pEGFP－C1表達載體中，見圖2。

Figure 1．Identification of PCR product of HLA－G gene by agarose gel electrophoresis．1，2:PCR product of HLA － G gene;3:marker．圖1 HLA－G基因PCR產(chǎn)物鑒定電泳圖

Figure 2．Agarose gel electrophoretic profile of recombinant expression plasmids digested by restrict endonucleases．1:the pEGFP－C1 plasmid digestion by Bam H I and Xho I(4 731 bp);2～7:the pEGFP－C1－HLA－G plasmid digested by Bam H I and Xho I(pEGFP－C1 is 4 731 bp and HLA－G is 1 017 bp);8:the pEGFP－C1－HLA－G plasmid without digestion(5 748 bp);9:marker．圖2 p EGFP－C1－HLA－G質(zhì)粒酶切鑒定電泳圖

3 HLA－G過表達質(zhì)粒測序鑒定

對初步鑒定為陽性的克隆提取質(zhì)粒。重組質(zhì)粒測序結(jié)果表明:插入片段與設(shè)計的HLA－G核苷酸序列完全一致，插入序列方向、位置及大小均正確，未發(fā)現(xiàn)有突變、缺失、插入等異常存在，表明已經(jīng)成功地構(gòu)建針對HLA－G基因的過表達質(zhì)粒，見圖3。

4 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染24 h后即有綠色熒光表達，轉(zhuǎn)染48 h后表達效率最高。經(jīng)G418篩選濃度維持2周后，挑取陽性克隆，進行擴大培養(yǎng)后，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Hep3B細胞系。熒光顯微鏡檢測發(fā)現(xiàn)，該細胞發(fā)出較強的綠色熒光，提示獲得了穩(wěn)定表達 HLA－G的Hep3B細胞系，見圖4。

Figure 3．Sequencing result of pEGFP－C1－HLA－G plasmid．圖3 pEGFP－C1－HLA－G質(zhì)粒的測序結(jié)果

Figure 4．Fluorescence microscope detection showed that pEGFP－C1 and pEGFP－C1－HLA－G were stably transfected into Hep3B cells(×100)．A:Hep3BGFP(phase－contrast);B:Hep3B－GFP(fluorescence);C:Hep3B－HLA－G(phase－contrast);D:Hep3B－HLA－G(fluorescence)．圖4 熒光顯微鏡檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP－C1和pEGFPC1－HLA－G的Hep3B細胞

5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Hep3B細胞后HLA－G mRNA的表達

Real－time PCR檢測 Hep3B、Hep3B－GFP和Hep3B－HLA－G各組 ΔCt值分別為0.00003±0.00000、0.00002±0.00000和0.00542±0.00149。其中Hep3B和Hep3B－GFP兩組RQ值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，Hep3B－HLA－G組與前兩組相比，RQ值差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，mRNA水平表達上調(diào)約180倍，見圖5。

6 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Hep3B細胞HLA－G蛋白的表達

Hep3B、Hep3B－GFP和Hep3B －HLA－G各組Western blotting結(jié)果顯示，HLA－G/β－actin吸光度比值分別為0.5698±0.1648、0.4748±0.1538和6.1188±0.1199，其中Hep3B和Hep3B－GFP兩組吸光度比值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，Hep3B－HLA－G與前兩組相比，吸光度比值差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，蛋白水平HLA－G表達上調(diào)約10倍，見圖6。

Figure 5．The mRNA expression of HLA －G detected by realtime PCR．ˉx±s．n=3．＊＊P＜0.01 vs Hep3B and Hep3B －GFP．圖5 Real－time PCR檢測各組HLA－G mRNA水平的變化

7 NK細胞殺傷活性的測定

NK細胞對 Hep3B、Hep3B－GFP和 Hep3BHLA－G細胞的殺傷率見圖7。未封閉HLA－ABC靶位點時，NK細胞對Hep3B組和Hep3B－GFP組殺傷率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);與前兩組相比，NK細胞對Hep3B－HLA－G組的殺傷明顯下降(P＜0.01)。封閉HLA－ABC靶位點后，NK細胞對靶細胞的殺傷較前均明顯增加(P＜0.01)，NK細胞對Hep3B(封閉)組和Hep3B－GFP(封閉)組的殺傷率無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);與前兩組相比，NK細胞對Hep3B－HLA－G(封閉)組的殺傷明顯下降(P＜0.01)。

討 論

Figure 6．The relative protein expression of HLA－G detected by Western blotting．ˉx±s．n=3．＊＊P＜0.01 vs Hep3B and Hep3B－GFP．圖6 Western blotting檢測各組HLA－G蛋白的表達

Figure 7．In vitro cell－killing effect of NK cells on Hep3B cells in different groups．ˉx±s．n=6．＊＊P＜0.01 vs Hep3B and Hep3B－GFP;△△P＜0.01 vs Hep3BHLA－G;##P＜0.01 vs Hep3B(block)and Hep3B－GFP(block)．圖7 NK細胞對不同處理組肝癌Hep3B細胞的殺傷作用

HLA－G定位于6號染色體短臂HLA遠端300 bp以內(nèi)，其由膜結(jié)合性重鏈和信號肽以非共價形式結(jié)合，重鏈需要與β2微球蛋白(β2－microglobulin，β2M)聯(lián)合才能與HLA－G配體結(jié)合［3］，并發(fā)揮生物作用。蛋白結(jié)構(gòu)分析表明，膜結(jié)合性重鏈包含3種免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域(α1～α3)，其中α1和α2結(jié)構(gòu)域由數(shù)個肽結(jié)合區(qū)組成。由于有限的基因多態(tài)性，到目前為止，從胎盤源生HLA－G分子中僅分離鑒定出3種肽分子［6－7］。HLA－G具有抑制免疫細胞的功能，其能抑制NK細胞和CTL細胞介導(dǎo)的細胞裂解以及T細胞增殖反應(yīng)［8］。近年來發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤細胞中檢測到HLA－G，它在腫瘤細胞中的異常表達同樣被認為可能是腫瘤細胞得以逃避宿主免疫監(jiān)視的手段［9－11］。

本研究經(jīng)過PCR、雙酶切及測序鑒定，表明插入片段與設(shè)計相符，成功構(gòu)建pEGFP－C1－HLAG過表達載體。通過Lipofectamine 2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染到肝癌Hep3B細胞，24 h后即有綠色熒光蛋白的表達，48 h后最強，經(jīng)過G418篩選，成功建立穩(wěn)定表達HLA－G的肝癌Hep3B細胞株。經(jīng)real－time PCR檢測證實，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后Hep3B－HLA－G組HLA－G mRNA水平上調(diào)約180倍，差異顯著(P＜0.01)。通過 Western blotting檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后Hep3B－HLA－G組HLA－G蛋白表達上調(diào)約10倍，顯著差異(P＜0.01)。目地基因在mRNA及蛋白水平上調(diào)并不一致，在以往文獻中也有類似報道［12］，我們推測可能的原因有:(1)pEGFP－C1表達載體采用CMV啟動子，可以高效促進外源性HLA－G基因轉(zhuǎn)錄;(2)HLA－G蛋白表達可能受轉(zhuǎn)錄后調(diào)控影響，蛋白質(zhì)經(jīng)過修飾、折疊、磷酸化及脫磷酸化都影響其抗原性，針對同一種蛋白質(zhì)的不同抗原形式，需要不同的抗體檢測。與NK細胞共培養(yǎng)，觀察到NK細胞對HLA－G過表達細胞細胞殺傷作用顯著減弱，進一步說明HLA－G可能是肝癌免疫逃逸的重要機制之一，HLA－G上調(diào)表達可以削弱NK細胞的免疫監(jiān)視功能。

近年來發(fā)現(xiàn)NK細胞主要通過“丟失自我”機制啟動殺瘤效應(yīng)，腫瘤細胞在丟失或變構(gòu)HLA－A、HLA－B和HLA－C的同時可高表達非經(jīng)典MHC－Ⅰ類分子(如 HLA－G、HLA－E)，傳遞強烈的殺傷抑制信號，致使腫瘤細胞在逃逸細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic lymphocyte，CTL)的殺傷作用后又逃逸NK細胞的殺傷作用。這在我們的研究中得到證實，抗體封閉肝癌Hep3B、Hep3B－GFP和Hep3BHLA－G細胞HLA－ABC靶位點時，NK細胞對其殺傷均明顯增強。這提示當(dāng)靶細胞表面經(jīng)典MHC－Ⅰ類分子表達下調(diào)后，NK細胞才能啟動對其殺傷。我們在HLA－E基因觀察到了相似的結(jié)果［13］，其確切機制目前尚不明確。我們推測，抗體封閉了靶細胞表面經(jīng)典MHC－Ⅰ類分子，使NK細胞的部分殺傷抑制性受體不能識別其配體而阻斷了負性信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致了NK細胞對這些靶細胞殺傷活性的增強。有文獻報道，HLA－G可與以下ILT－2、ILT －4、KIR2DL4 等［14－15］受體結(jié)合，向 NK 細胞傳遞抑制性信號，但究竟通過何種途徑引發(fā)一系列下游事件，從而使得NK細胞發(fā)生改變，仍需要進一步研究。

綜上所述，本實驗成功構(gòu)建HLA－G過表達載體，特異性上調(diào)HLA－G表達，成功建立HLA－G過表達細胞模型，并證實HLA－G可以削弱NK細胞免疫監(jiān)視功能，為進一步研究HLA－G的功能及其在肝癌免疫逃逸中的作用及機制奠定了實驗基礎(chǔ)。

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