近足月胎兔持續(xù)宮內(nèi)缺氧缺血性腦損傷模型的建立*

王能里， 南 燕， 柳艷麗， 林 素， 葉 偉， 唐震海， 林 錦， 林振浪

(溫州醫(yī)學(xué)院附屬育英兒童醫(yī)院新生兒科，浙江 溫州 325027)

1000-4718(2012)04-0760-06

2011-10-05

2011-12-27

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.Y2101067)；浙江省科技廳錢江人才計(jì)劃項(xiàng)目(No.2009R10054)；溫州市科技局對外科技合作交流項(xiàng)目(No.H2008055)

△通訊作者 Tel: 0577-88816211; E-mail: linzhenlang@hotmail.com

·實(shí)驗(yàn)技術(shù)·

近足月胎兔持續(xù)宮內(nèi)缺氧缺血性腦損傷模型的建立*

王能里， 南 燕， 柳艷麗， 林 素， 葉 偉， 唐震海， 林 錦， 林振浪△

(溫州醫(yī)學(xué)院附屬育英兒童醫(yī)院新生兒科，浙江 溫州 325027)

目的建立近足月(29 d胎齡)胎兔持續(xù)宮內(nèi)缺氧缺血性腦損傷模型，為深入研究新生兒缺氧缺血性腦損傷發(fā)病機(jī)制和治療提供合適模型。方法選擇孕29 d健康新西蘭白兔24只，聯(lián)合全身麻醉和腰麻對孕兔進(jìn)行麻醉，從左側(cè)股動(dòng)脈插入4F Fogarty動(dòng)脈取栓導(dǎo)管，實(shí)驗(yàn)組向?qū)Ч芮蚰覂?nèi)注入生理鹽水0.3 mL阻斷孕兔子宮血供，阻斷時(shí)間分別為20 min、25 min、28 min、30 min和40 min，每組4只；對照組插管后不注入生理鹽水，共4只。24 h后行剖宮產(chǎn)，記錄新生兔一般情況，評估新生兔神經(jīng)行為學(xué)和腦組織病理學(xué)改變。結(jié)果麻醉過程中孕兔生命體征穩(wěn)定，未發(fā)生低氧血癥，對麻醉耐受性良好。實(shí)驗(yàn)組向?qū)Ч芮蚰覂?nèi)注入生理鹽水0.3 mL后孕兔右側(cè)股動(dòng)脈搏動(dòng)消失，血壓測不出；而對照組血壓無明顯波動(dòng)(P>0.05)。持續(xù)阻斷子宮血供導(dǎo)致胎兔和新生兔死亡，存活新生兔神經(jīng)行為學(xué)異常,腦細(xì)胞發(fā)生凋亡。阻斷子宮血供20 min時(shí)，未發(fā)現(xiàn)死胎，新生兔行為學(xué)和腦組織病理學(xué)改變不明顯；阻斷子宮血供25 min和28 min時(shí)，死胎率分別為12.9%和40.6%，存活新生兔出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)行為異常，腦組織切片發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞腫脹，小膠質(zhì)細(xì)胞活化，腦細(xì)胞凋亡；而阻斷子宮血供超過30 min時(shí)，死胎率高達(dá)80.0%。結(jié)論持續(xù)阻斷孕兔子宮血供導(dǎo)致胎兔死亡、新生兔神經(jīng)行為學(xué)異常及腦組織病理學(xué)改變，且不同阻斷時(shí)間引起不同程度的腦損傷；持續(xù)阻斷子宮血供25～28 min，可為缺氧缺血性腦損傷的相關(guān)研究提供合適的胎兒期全身性缺氧缺血性腦損傷胎兔模型。

缺氧缺血，腦; 模型，動(dòng)物; 兔

新生兒缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage, HIBD)是圍生期窒息引起腦組織缺氧缺血性損害，是導(dǎo)致新生兒傷殘的重要原因之一[1-2]，嚴(yán)重威脅新生兒的生命健康[3]。深入研究HIBD的發(fā)病機(jī)制和尋找有效的防治策略是國內(nèi)外圍生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要課題[4]，因此模擬新生兒HIBD的臨床過程，建立胎兒期全身性HIBD動(dòng)物模型具有十分重要的意義，胎兔宮內(nèi)HIBD模型正是這樣一種模型。本研究模擬急性胎盤功能不全的臨床過程，建立近足月(29 d胎齡)胎兔持續(xù)宮內(nèi)缺氧缺血性腦損傷模型，為深入研究新生兒缺氧缺血性腦損傷發(fā)病機(jī)制和防治措施提供合適動(dòng)物模型。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動(dòng)物及分組 孕29 d健康新西蘭白兔24只，體重為3.3～3.8 kg，由上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。24只孕兔隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組20只和對照組4只。實(shí)驗(yàn)組按阻斷子宮血供時(shí)間隨機(jī)分為20 min組、25 min組、28 min組、30 min組和40 min組(各4只)，分別記為E20、E25、E28、E30和E40組。

1.2主要儀器設(shè)備和試劑 血?dú)?電解質(zhì)分析儀(Instrumentation Laboratory)；BeneView T5生命體征監(jiān)測儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；WZS-50F微量輸液泵(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)器械廠)；YP-90新生兒培養(yǎng)箱(寧波戴維器械有限公司)；Fogarty動(dòng)脈取栓導(dǎo)管(4F, Edwards Lifesciences)；Griffoniasimplicifoliaisolectin B4(IB4)(Vector Labs)；TUNEL試劑盒(InSituCell Death Detection Kit, POD; Roche)。

2方法

2.1HIBD模型的建立

2.1.1麻醉及補(bǔ)液 聯(lián)合全身麻醉和腰麻對孕兔進(jìn)行麻醉。全身麻醉分為誘導(dǎo)麻醉和維持麻醉2個(gè)階段，左側(cè)耳緣靜脈內(nèi)持續(xù)泵入給藥。誘導(dǎo)麻醉給予芬太尼(0.075 mg·kg-1·h-1)和氟哌利多(3.75 mg·kg-1·h-1)，泵入5～10 min；維持麻醉給予芬太尼(0.025～0.05 mg·kg-1·h-1)和氟哌利多(1.25～2.5 mg·kg-1·h-1)，泵入至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。腰麻以L4～L5椎間隙為進(jìn)針點(diǎn)，向蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)注入0.75%布比卡因0.3～0.5 mL。葡萄糖生理鹽水溶液按10～15 mL·kg-1·h-1耳緣靜脈內(nèi)持續(xù)泵入。

2.1.2阻斷孕兔子宮血供 沿左側(cè)腹股溝中點(diǎn)切開皮膚，游離左側(cè)股動(dòng)脈并做一縱向切口，插入4F Fogarty動(dòng)脈取栓導(dǎo)管，約10 cm，此時(shí)球囊位于腎動(dòng)脈開口下端，子宮動(dòng)脈開口上端[5]。實(shí)驗(yàn)組向球囊內(nèi)注入生理鹽水0.3 mL擴(kuò)張球囊，對照組不注入生理鹽水，分別保留20、25、28、30、40 min后拔出導(dǎo)管，縫合血管、皮膚。

2.1.3術(shù)中監(jiān)測 孕兔左側(cè)耳中動(dòng)脈置入靜脈留置針(20G)，連接有創(chuàng)血壓監(jiān)測儀，監(jiān)測外周動(dòng)脈血壓；右側(cè)耳緣連接經(jīng)皮氧飽和度監(jiān)測儀；人工計(jì)數(shù)呼吸頻率，根據(jù)監(jiān)測結(jié)果及時(shí)調(diào)整麻醉藥物給藥劑量。在全身麻醉前、誘導(dǎo)麻醉完成后10 min、股動(dòng)脈插管前10 min、拔管后10 min、拔管后4～5 h從孕兔左側(cè)耳中動(dòng)脈采血，30 min內(nèi)送檢血?dú)夥治?，記錄呼吸頻率、心率、血氧飽和度(SpO2)和血?dú)夥治鼋Y(jié)果。同時(shí)監(jiān)測孕兔右側(cè)股動(dòng)脈搏動(dòng)及血壓。

2.2新生兔的評估

2.2.1阻斷孕兔子宮血供24 h后行剖宮產(chǎn)，新生兔置入預(yù)熱的新生兒培養(yǎng)箱中保暖(箱溫為35 ℃)，記錄單窩產(chǎn)崽數(shù)、死胎率、出生體重等。

2.2.2活產(chǎn)新生兔立即進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分：主要評估項(xiàng)目包括姿勢、翻正反射、肌張力、運(yùn)動(dòng)能力、吮吸和吞咽協(xié)調(diào)能力、對刺激的反應(yīng)[6-7]。但如果活產(chǎn)新生兔在神經(jīng)行為學(xué)評估前或評估過程中發(fā)生死亡，其評分結(jié)果視為無效評分，不被納入統(tǒng)計(jì)范疇。

2.3病理學(xué)觀察

2.3.1HE染色 待行為學(xué)評估完成后，立即腹腔內(nèi)注射5%水合氯醛(250 mg/kg)，4%多聚甲醛心臟灌注，斷頭取腦組織，制作石蠟標(biāo)本，切片，行HE染色。

2.3.2標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞 石蠟切片常規(guī)脫蠟、逐級水化，用3%H2O250 μL孵育20 min，加入50 μL生物素標(biāo)記的IB4(2.5 mg/L)孵育30 min，滴加HRP標(biāo)記的鏈霉卵蛋白50 μL孵育30 min。

2.3.3標(biāo)記凋亡的腦細(xì)胞 按TUNEL試劑盒設(shè)計(jì)的程序進(jìn)行：加蛋白酶K(20 mg/L)50 μL孵育5 min，滴加TUNEL反應(yīng)液(Enzyme solution 5 μL，Label solution 45 μL)50 μL孵育1 h；加POD轉(zhuǎn)化液50 μL孵育30 min。

2.3.4以上各步均用0.01 mol/LPBS 充分沖洗。DAB顯色；蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封固，顯微鏡下觀察，對存活新生兔腦組織海馬CA1區(qū)、紋狀體、大腦矢狀旁區(qū)皮質(zhì)每高倍視野內(nèi)陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1孕兔一般情況

對照組和各實(shí)驗(yàn)組孕兔體重、單窩產(chǎn)崽數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。任意監(jiān)測時(shí)點(diǎn)，各組孕兔呼吸頻率、心率、PaO2、PaCO2、SpO2和外周動(dòng)脈血壓比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。心率、SpO2和外周動(dòng)脈血壓在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中無明顯波動(dòng)，但誘導(dǎo)麻醉導(dǎo)致孕兔呼吸頻率和PaO2明顯降低，PaCO2增高(P<0.05)，進(jìn)入維持麻醉階段后孕兔呼吸頻率、血PO2和PCO2逐漸趨向穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)組向?qū)Ч芮蚰易⑷肷睇}水0.3 mL，孕兔右側(cè)股動(dòng)脈搏動(dòng)消失，血壓測不出，但置管前和拔管后血壓比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；拔管后實(shí)驗(yàn)組孕兔動(dòng)脈血乳酸水平高于對照組，分別為(2.13±0.82)mmol/L和(1.34±0.39) mmol/L(P<0.05)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，對照組右側(cè)股動(dòng)脈均可觸及明顯波動(dòng)，血壓波動(dòng)不明顯。孕兔一般情況見表1，這些數(shù)據(jù)對在國內(nèi)建立胎兔宮內(nèi)HIBD模型有重要意義。

2胎兔及新生兔存活情況

對照組產(chǎn)崽共31只；實(shí)驗(yàn)組E20、E25、E28、E30和E40分別產(chǎn)崽32只、31只、32只、25只和31只。對照組所有胎兔存活，實(shí)驗(yàn)組阻斷子宮血供造成部分胎兔死亡，且阻斷時(shí)間越長，活產(chǎn)新生兔的數(shù)量越少，死胎率越高(P<0.05)，見表2。E20組和對照組活產(chǎn)新生兔活力較好，無新生兔死亡；而E25組、E28組和E30組部分活產(chǎn)新生兔活力較差，生后不久即發(fā)生死亡，其中E30組所有活產(chǎn)新生兔生后不久均死亡，其原因可能是發(fā)生嚴(yán)重缺氧缺血性腦損傷的新生兔沒有ICU監(jiān)護(hù)較難存活[6]。

表1 孕兔一般情況

PaO2:arterial oxygen partial pressure;SpO2:pulse oxygen saturation;PaCO2:arterial carbon dioxide partial pressure.*P<0.05vsbefore anesthesia.

表2 胎兔及新生兔存活情況

3新生兔行為學(xué)評估

本研究各組有效的神經(jīng)行為學(xué)評分例數(shù)分別為：對照組31例、E20組32例、E25組25例、E28組14例，而E30組活產(chǎn)新生兔生后不久均發(fā)生死亡，沒有有效的神經(jīng)行為學(xué)評分結(jié)果。比較神經(jīng)行為學(xué)評分結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組新生兔的姿勢、翻正次數(shù)、翻正得分、運(yùn)動(dòng)能力、吮吸和吞咽協(xié)調(diào)能力及嗅覺刺激等項(xiàng)目評分均低于對照組，且宮內(nèi)缺氧缺血時(shí)間越長，神經(jīng)行為學(xué)評分越低(P<0.05)，見表3；E20組新生兔神經(jīng)行為學(xué)評分較對照組有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。另外，所有存活新生兔均未出現(xiàn)肌張力增高，同樣證實(shí)肌張力增高僅見于早產(chǎn)胎兔缺氧缺血性腦損傷模型[6]，這可能與不成熟腦白質(zhì)對缺氧缺血敏感有關(guān)[8-9]，原因可能是不成熟腦白質(zhì)中的前體少突膠質(zhì)細(xì)胞對缺氧缺血產(chǎn)生的氧自由基極度敏感[10-11]。

4大體標(biāo)本及免疫組織化學(xué)

實(shí)驗(yàn)組新生兔顱縫較對照組增寬，E30組增寬最為明顯，順產(chǎn)極可能增加死胎率[6]。存活新生兔腦組織標(biāo)本經(jīng)HE染色，見圖1，對照組大腦矢狀旁區(qū)腦細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞形態(tài)規(guī)整，細(xì)胞間隙清晰；實(shí)驗(yàn)組腦細(xì)胞腫脹，排列紊亂，胞質(zhì)、胞核染色不均，細(xì)胞間隙不清。腦組織切片經(jīng)IB4染色后，對照組和實(shí)驗(yàn)組均可見呈棕色的陽性細(xì)胞，但對照組陽性細(xì)胞形態(tài)學(xué)上呈樹枝狀，為靜息態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)組陽性細(xì)胞呈橢圓形或阿米巴樣，為活化的小膠質(zhì)細(xì)胞[7]，見圖2。

表3 存活新生兔神經(jīng)行為學(xué)評分

★P<0.05vscontrol;◆P<0.05vsE20;●P<0.05vsE25.

Figure 1. The morphological changes of brain cells in sagittal brain areas of newborn rabbits (HE staining,×200). A: control group, most brain cells with regular shape and uniform staining; B, C, D: E20, E25 and E28 groups, respectively, with swelling brain cells and unclear cell gaps.

圖1HE染色顯示大腦矢狀旁區(qū)腦細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變

Figure 2. The morphological changes of microglia in hippocampus CA1 of newborn rabbits(IB4 staining,×400). A: control group, the microglial cells were highly ramified (arrows). B, C, D: E20, E25 and E28 groups, respectively, the microglial cells showed amoeboid morphology (arrows).

圖2IB4染色后海馬CA1區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

實(shí)驗(yàn)組存活新生兔腦組織切片中可見較多TUNEL陽性細(xì)胞(呈棕色)，對照組未發(fā)現(xiàn)或僅有極少量TUNEL陽性細(xì)胞，見圖3；其中海馬、紋狀體、大腦矢狀旁區(qū)皮質(zhì)等部位凋亡現(xiàn)象較為突出，每高倍視野內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)較對照組明顯增多(數(shù)據(jù)未給出)，且隨阻斷子宮血供時(shí)間的延長逐漸增加(P<0.05)。

Figure 3. The apoptosis of brain cells in striaturn in newborn rabbits (TUNEL,×400). A: control group, no apoptotic brain cells; B, C, D: E20, E25 and E28 groups, respectively,the positive cells were apoptotic brain cells (arrows).

圖3TUNEL染色后紋狀體內(nèi)腦細(xì)胞凋亡情況

討 論

建立缺氧缺血性腦損傷(HIBD)動(dòng)物模型的方法較多，最為經(jīng)典的是Rice法[12]，但由于是通過結(jié)扎新生鼠一側(cè)頸動(dòng)脈建立的局部單側(cè)缺氧缺血性腦損傷模型，不能模擬宮內(nèi)窒息所致的胎兒全身性缺氧缺血的臨床過程。Matthew等[7]利用孕兔，模擬胎盤功能不全的臨床過程，通過暫時(shí)性阻斷孕兔子宮血供造成胎兔宮內(nèi)缺氧缺血，建立起胎兒期全身性胎兔HIBD模型。而兔腦發(fā)育與人類極為相似，被認(rèn)為是人腦發(fā)育的縮略圖[6]，且胎兔模型具有較典型的神經(jīng)行為學(xué)損害[6-7]，胎兔宮內(nèi)HIBD模型被認(rèn)為是深入研究新生兒HIBD發(fā)病機(jī)制和防治措施的合適的模型[13]。Sidhartha等[6]已成功建立了早產(chǎn)胎兔持續(xù)宮內(nèi)缺氧缺血性腦損傷模型和近足月胎兔間歇宮內(nèi)缺氧缺血性腦損傷模型，而對近足月胎兔持續(xù)宮內(nèi)缺氧缺血性腦損傷模型阻斷孕兔子宮血供的時(shí)間沒有明確定義；持續(xù)阻斷孕29 d孕兔子宮血供50 min，可造成胎兔腦細(xì)胞損傷和壞死[14]，但由于可造成100%的死胎率，無法進(jìn)行缺氧缺血后神經(jīng)行為學(xué)及干預(yù)療效相關(guān)研究，故持續(xù)阻斷孕29 d孕兔子宮血供50 min，不能建立理想的近足月胎兔持續(xù)宮內(nèi)缺氧缺血性腦損傷模型。本研究擬建立近足月(29 d胎齡，約92.1%孕齡)胎兔持續(xù)宮內(nèi)缺氧缺血性腦損傷模型。

建立胎兔宮內(nèi)缺氧缺血性腦損傷模型的技術(shù)關(guān)鍵主要有兩個(gè)，其一是避免孕兔發(fā)生低氧血癥和死亡。文獻(xiàn)報(bào)道對孕兔進(jìn)行麻醉時(shí)，需要使用呼吸機(jī)或者復(fù)蘇囊-面罩加壓通氣維持通氣[6-7,14]，這不利于胎兔宮內(nèi)缺氧缺血性腦損傷模型的推廣。本研究誘導(dǎo)麻醉采用耳緣靜脈泵入，誘導(dǎo)劑量完成后加用大劑量維持，5 min后改用小劑量維持到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。我們實(shí)時(shí)監(jiān)測孕兔的呼吸、心率、經(jīng)皮SPO2、外周動(dòng)脈血壓、動(dòng)脈血?dú)夥治龅?，及時(shí)評估孕兔的麻醉深度，并根據(jù)監(jiān)測結(jié)果及時(shí)調(diào)整麻醉給藥劑量。在無任何輔助通氣的情況下，本研究所有孕兔均未出現(xiàn)嚴(yán)重呼吸抑制，無低氧血癥、高碳酸血癥發(fā)生，有效避免因麻醉過度發(fā)生死亡。

實(shí)現(xiàn)子宮血供中斷造成適度的宮內(nèi)缺氧缺血，是建立胎兔HIBD模型的另一個(gè)技術(shù)關(guān)鍵。文獻(xiàn)報(bào)道向球囊內(nèi)注入0.4 mL或0.3 mL生理鹽水[13,15]，均可實(shí)現(xiàn)子宮血供的中斷。我們的前期研究表明，向球囊內(nèi)注入0.4 mL生理鹽水，部分孕兔出現(xiàn)腹主動(dòng)脈破裂，迅速死亡；而注入0.3 mL生理鹽水未出現(xiàn)此現(xiàn)象。本研究向球囊內(nèi)注入0.3 mL生理鹽水，導(dǎo)管充盈后，孕兔右側(cè)股動(dòng)脈脈搏消失、血壓測不出，與Sidhartha等[6]報(bào)道一致；拔除導(dǎo)管后，孕兔循環(huán)中的乳酸水平明顯增高，這與球囊以下血供(包括子宮)被阻斷發(fā)生無氧代謝有關(guān)，提示實(shí)現(xiàn)孕兔子宮血供中斷。但由于乳酸等酸性物質(zhì)有可能加重胎兔腦損傷[16-17]，本研究給予適當(dāng)補(bǔ)液，維持穩(wěn)定的外周動(dòng)脈灌注壓，增加孕兔腎血流量，促進(jìn)酸性物質(zhì)排出[18]，減少非實(shí)驗(yàn)因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。拔除導(dǎo)管4～5 h后，孕兔動(dòng)脈血乳酸水平恢復(fù)至術(shù)前水平。

由于陰道產(chǎn)可增加死胎率，且存在食崽現(xiàn)象[6]，本研究采用剖宮產(chǎn)希望得出更為準(zhǔn)確的死胎率。與文獻(xiàn)報(bào)道[9]不同，本研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)阻斷子宮血供40 min，死胎率為100%；降低阻斷時(shí)間至30 min時(shí)，死胎率仍高達(dá)80.0%；當(dāng)降至28 min時(shí)，死胎率為40.6%，過高的死胎率不利于科學(xué)研究，故本研究認(rèn)為阻斷子宮血供的時(shí)間不宜超過28 min。當(dāng)阻斷子宮血供時(shí)間為25～28 min時(shí)，死胎率分別為12.9%和40.6%，存活新生兔出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)行為學(xué)異常，病理切片可見明顯腫脹的腦細(xì)胞、活化的小膠質(zhì)細(xì)胞及發(fā)生凋亡的腦細(xì)胞，腦損傷較為典型[7]，提示阻斷子宮血供25～28 min是建立29d胎齡胎兔持續(xù)宮內(nèi)缺氧缺血性腦損傷模型的合理時(shí)間。繼續(xù)降低阻斷時(shí)間至20 min，存活新生兔的神經(jīng)行為學(xué)評估結(jié)果與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，腦組織病理切片僅可見活化的小膠質(zhì)細(xì)胞，凋亡現(xiàn)象不明顯，提示阻斷子宮血供20 min可引起小膠質(zhì)細(xì)胞大量活化[19]，未造成或僅造成輕微的神經(jīng)系統(tǒng)損傷，因此持續(xù)阻斷子宮血供20 min或小于20 min不是建模的合理時(shí)間。

綜上所述，本研究有效避免呼吸機(jī)的應(yīng)用及孕兔死亡，進(jìn)一步減少非實(shí)驗(yàn)因素對研究結(jié)果的影響。持續(xù)阻斷孕兔子宮血供導(dǎo)致胎兔死亡、新生兔神經(jīng)行為學(xué)異常及腦組織病理學(xué)改變，且不同阻斷時(shí)間引起不同程度的腦損傷；持續(xù)阻斷子宮血供25～28 min，可為缺氧缺血性腦損傷的相關(guān)研究提供合適的胎兒期全身性缺氧缺血性腦損傷胎兔模型。

[1] Deorari AK, Paul VK, Singh M, et al. The national movement of neonatal resuscitation in India [J]. J Trop Pediatr, 2000,46(5):315-317.

[2] 許曉霞, 欒 佐, 古桂雄, 等. 新生大鼠重度缺氧缺血性腦損傷模型的建立[J]. 中國新生兒科雜志, 2009,24(3):165-167.

[3] 段 濤, 陳 超. 新生兒缺氧缺血性腦病(I)[J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志, 2005, 85(17):1218.

[4] Glass HC, Ferriero DM. Treatment of hypoxic- ischemic encephalopathy in newborns[J]. Curr Treat Options Neurol, 2007,9(6):414-423.

[5] Derrick M, He J, Brady E, et al. Theinvitrofate of rabbit fetal brain cells after acuteinvivohypoxia [J]. J Neurosci, 2001,21(7):RC138.

[6] Sidhartha T, Alexander D, Tamas J, et al. Model of cerebral palsy in the perinatal rabbit [J]. J Child Neurol, 2005,20(12):972-979.

[7] Matthew D, Ning LL, Joanne CB, et al. Preterm fetal hypoxia-ischemia causes hypertonia and motor deficits in the neonatal rabbit: model for human cerebral palsy?[J]. J Neurosci, 2004,24(1):24-34.

[8] Drobyshevsky A, Song SK, Gamkrelidze G, et al. Developmental changes in diffusion anisotropy coincide with immature oligodendrocyte progression and maturation of compound action potential[J]. J Neurosci, 2005, 25(25):5988-5997.

[9] Back SA, Luo NL, Mallinson RA, et al. Selective vulnerability of preterm white matter to oxidative damage defined by F2-isoprostanes[J]. Ann Neurol，2005, 58(1):108-120.

[10]Drobyshevsky A, Derrick M, Wyrwicz A, et al. White matter injury correlates with hypertonia in an animal model of cerebral palsy[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2007, 27(2):270-281.

[11]Baud O, Greene A, Li J, et al. Glutathione peroxidase-catalase cooperativity is required for resistance to hydrogen peroxide by mature rat oligodendrocytes[J]. J Neurosci, 2004, 24(7):1531-1540.

[12]Rice JE, Vannucci RC, Brierley JB. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat[J]. Ann Neurol,1981,9(2):131-141.

[13]Matthew D, Alexander D, Ji XH, et al. A model of cerebral palsy from fetal hypoxia-ischemia [J]. Stroke, 2007,38(2):731-735.

[14]Buser JR, Segovial KN, Dean JM, et al. Timing of appearance of late oligodendrocyte progenitors coincides with enhanced susceptibility of preterm rabbit cerebral white matter to hypoxia-ischemia[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2010, 30(5):1053-1065.

[15]Tan S, Zhou F, Nielsen VG, et al. Increased injury following intermittent fetal hypoxia-reoxygenation is associated with increased free radical production in fetal rabbit brain[J]. J Neuropathol Exp Neurol, 1999,58(9):972-981.

[16]Lee CC, Chang IJ, Yen ZS, et al. Effect of different resuscitation fluids on cytokine response in rat model of hemorrhagic shock[J]. Shock, 2005,24(2):177-181.

[17]宋 娟, 邵 芹, 葛亞麗,等. 不同滲透濃度晶體液對失血性休克大鼠血腦屏障和腦水腫的影響[J]. 醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào),2008, 21(3):255-259.

[18]趙紅立, 陳英才. 新生兒缺氧缺血性腦病陰離子間隙測定及其意義[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2004,13(16):2107-2108.

[19]Sujatha K, Fadoua SM, Otto MM, et al. Microglial activation in perinatal rabbit brain induced by intrauterine inflammation: detection with11C-(R)-PK11195 and small-animal PET[J]. J Nucl Med, 2007,48(6):946-954.

Establishmentofintrauterinehypoxic-ischemicbraindamagemodelinneartermfetalrabbits

WANG Neng-li, NAN Yan, LIU Yan-li, LIN Su, YE Wei, TANG Zhen-hai, LIN Jin, LIN Zhen-lang

(DepartmentofNeonatology,TheYuyingChildren’sHospitalofWenzhouMedicalCollege,Wenzhou325027,China.E-mail:linzhenlang@hotmail.com)

AIM: To establish intrauterine hypoxic-ischemic brain damage (HIBD) model in near term fetal rabbits at 29 d gestation age for the investigation of the pathogenesis and treatment of newborn HIBD.METHODSTwenty-four pregnant New Zealand white rabbits at 29th gestational day were chosen for this project. Under combined general anesthesia and spinal anesthesia, a 4F Fogarty arterial embolectomy catheter was introduced into the left femoral artery. The blood supply of uterus in experiment group was blocked by inflating the catheter balloon with 0.3 mL saline for 20 min, 25 min, 28 min, 30 min and 40 min (n=4 for each experimental time group). The catheter balloon was not inflated in control group (n=4). All pregnant rabbits were subject to cesarean section 24 h after the experimental procedure to induce hypoxia-ischemia to the fetus. The general conditions of the newborn rabbits were recorded, and the neurobehavioral damage and histology of the brain tissue were assessed.RESULTSDuring the entire procedure, the pregnant rabbits had stable vital signs, no hypoxia happened,and had a good tolerance to the anesthesia program. When the balloon was inflated, the pulses of right femoral artery disappeared and the right leg blood pressure became non-detectable in experimental groups. In contrast, no fluctuation of the right leg blood pressure in control group (P>0.05) was observed. Intrauterine hypoxia-ischemia caused neonatal and fetal rabbit death, neurobehavioral damage and brain cell death. When the balloon was inflated for 20 min, all fetal rabbits were alive and had no obvious neurologic damage. For 25～28 min, the stillbirth rates were 12.9% and 40.6%, respectively, while the live neonatal rabbits manifested neurobehavioral damage, edema neural cells, activated microglia cells and apoptotic brain cells. When blocking time beyond 30 min, above 80% fetal rabbits died.CONCLUSIONContinuous blockage of uterine blood supply in pregnant rabbits causes neonatal rabbit death, neurobehavioral damage and brain cell death. Different blocking time arouses different levels of brain damage. Continuous blockage of uterine blood supply for 25-28 min can establish fetal generalize hypoxic-ischemic brain damage rabbit model, which is a good animal model for the investigation of newborn HIBD.

Hypoxia-ischemia, brain; Models,animal; Rabbits

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.04.034