新西蘭兔糖尿病腎病模型的建立方法*

陳小明， 黃丹丹， 李自成

(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 廣州 510632)

1000-4718(2012)04-0765-04

2011-12-22

2012-02-24

廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金資助項(xiàng)目(No. WSTJJ20081120420111197405185045)；暨南大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院重點(diǎn)學(xué)科基金項(xiàng)目(No.暨一臨[2010]4);廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2010-1096-136)

△通訊作者 Tel: 020-38688620; E-mail:zichengli@163.net

新西蘭兔糖尿病腎病模型的建立方法*

陳小明， 黃丹丹， 李自成△

(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 廣州 510632)

目的探討小劑量四氧嘧啶(ALX)建立新西蘭兔糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)模型的可行性。方法雄性新西蘭兔20只，8只為對(duì)照組，給予常規(guī)飼料，12只為糖尿病組，給予高糖高脂飲食(常規(guī)飼料加5%蔗糖、5%豬油和1%膽固醇)喂養(yǎng)2周，再加用小劑量ALX耳緣靜脈注射，分別檢測(cè)造模前與造模12周后兔血糖、血脂、尿蛋白和腎功能指標(biāo)，并于12周后進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果建模成功動(dòng)物具有“多飲、多食、多尿、體重減輕”的特點(diǎn)，并出現(xiàn)DN相應(yīng)的形態(tài)及功能改變。結(jié)論高脂高糖飲食加ALX藥物誘導(dǎo)的方法，12 周時(shí)可成功制備新西蘭兔2型DN模型。

新西蘭兔； 糖尿病腎病； 四氧嘧啶； 模型，動(dòng)物

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥之一，在糖尿病人群中的發(fā)生率為20%～40%。在西方國(guó)家人群中，DN已成為終末期腎功能衰竭(end-stage renal disease, ESRD)的主要原因，也是糖尿病致命的主要原因。我國(guó)DN發(fā)病率也呈逐年增多趨勢(shì)，越來(lái)越成為亟待解決的腎臟病。然而，糖尿病腎病的病因和發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，迄今尚未完全明了[1-2]。在對(duì)DN進(jìn)行機(jī)制研究時(shí)，比較生物學(xué)的方法是很重要的研究手段，因此，建立適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型，不僅為研究糖尿病腎病的病因、發(fā)病機(jī)制和病理生理改變提供重要線索，而且能促進(jìn)藥物作用機(jī)制的研究和臨床藥物的開(kāi)發(fā)。目前國(guó)內(nèi)多用鼠類DN模型進(jìn)行研究，而新西蘭兔較鼠類存活率高，模型穩(wěn)定，重復(fù)性好，且抗病性強(qiáng)，利于反復(fù)采血，方便灌胃及靜脈注射藥物干預(yù)、便于進(jìn)行組織器官影像學(xué)檢查。本實(shí)驗(yàn)旨在應(yīng)用高糖高脂飲食誘發(fā)胰島素抵抗,再以小劑量四氧嘧啶(alloxan, ALX)破壞兔胰島細(xì)胞形成糖尿病,探討新西蘭兔2型DN模型的建立方法。

材 料 和 方 法

1動(dòng)物

清潔級(jí)雄性新西蘭兔20只(由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),許可證號(hào)為SCXK(粵)2008-0002。體重2.0～2.5 kg。隨機(jī)分成糖尿病組(A組，12只)和對(duì)照組(B組,8只)。

2主要試劑

ALX和膽固醇均購(gòu)自Sigma，血糖測(cè)定采用強(qiáng)生公司One TouchⅡ血糖儀和試紙條。基礎(chǔ)飼料購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，高脂飼料由廣東省暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心加工形成。生化檢測(cè)由暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科完成。

3方法

3.1飲食誘發(fā)胰島素抵抗 B組(對(duì)照組)喂以常規(guī)飼料(蛋白質(zhì)31.10%，脂肪7.79%，其它61.11%)，A組(糖尿病組)喂以高糖高脂飼料(常規(guī)飼料加5%蔗糖、5%豬油和1%膽固醇)。適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，測(cè)空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)及血脂、超敏C反應(yīng)蛋白(high-sensitivity C-reactive protein, hs-CRP)、肌酐水平，血標(biāo)本在耳緣靜脈采取。膽固醇和甘油三酯水平較空白組升高者考慮誘發(fā)胰島素抵抗[3]。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中兔進(jìn)食含2%膽固醇、10%豬油和5%蔗糖的高脂飼料后有猝死或中風(fēng)癱瘓，考慮到兔為草食性動(dòng)物，且ALX造成胰腺損傷，不能適應(yīng)高脂飼料，遂調(diào)整高脂配方為常規(guī)飼料加5%蔗糖、5%豬油和1%膽固醇。

3.2小劑量ALX注射誘導(dǎo)糖尿病 適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，A組動(dòng)物禁食水12 h后，耳緣靜脈注射ALX 50 mg/kg，隔天禁食水12 h后再耳緣靜脈注射ALX 100 mg/kg(均以注射用水配成5%濃度)，注藥后24 h內(nèi)因胰島細(xì)胞破壞，大量胰島素入血，動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重低血糖，注藥后48 h內(nèi)給予10%葡萄糖水自由攝取，幫助其渡過(guò)低血糖期，注藥48～72 h后血糖即升高，第1周需要密切監(jiān)測(cè)血糖，若有超過(guò)30 mmol/L者給予普通胰島素(1～2U/kg)皮下注射以幫助其渡過(guò)血糖紊亂期(視血糖波動(dòng)情況調(diào)整用量)。B組動(dòng)物僅注射等量注射用水。注射ALX 1周后，隨機(jī)血糖大于16.7 mmol/L者入選為糖尿病組，繼續(xù)原飼料喂養(yǎng)。

4指標(biāo)與測(cè)定方法

分別于注射ALX前及注射ALX 12周后收集血尿標(biāo)本，用自動(dòng)生化儀檢測(cè)血糖、血甘油三酯、膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、血肌酐(serum creatinine, SCr)、尿微量白蛋白等指標(biāo)。注射ALX 12周后，處死動(dòng)物，立即打開(kāi)腹腔游離腎臟，于10%中性甲醛液中固定，脫水、包埋、切片。行HE染色，光鏡下觀察其形態(tài)學(xué)改變。

5判斷標(biāo)準(zhǔn)

2型DN兔需具備以下條件：(1)有“多飲、多食、多尿、體重減輕”癥狀，隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L；(2) 出現(xiàn)蛋白尿、腎功能異常及相應(yīng)腎臟組織病理學(xué)特征。

6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1新西蘭兔糖尿病模型建模

與空白組對(duì)比，糖尿病組兔注射ALX后出現(xiàn)三多一少、脫毛、活動(dòng)減少等癥狀；其中1只兔在ALX注射后12 h死于低血糖，1只兔在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前死于感染；部份動(dòng)物在注射ALX 1個(gè)月后血糖逐漸下降，可能與胰島細(xì)胞修復(fù)有關(guān)。全程給予5～10%葡萄糖水(濃度依個(gè)體血糖而定)自由飲用有利于保持模型穩(wěn)定，2只兔在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)血糖低于16.7 mmol/L。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物低血糖死亡率為8.3% (1/12)，糖尿病模型建模率為91.7% (11/12)，糖尿病成模后的死亡率為9%(1/11)。

2對(duì)比實(shí)驗(yàn)中兔各項(xiàng)指標(biāo)

可見(jiàn)糖尿病組兔在成模12周后血糖明顯升高(P<0.05),出現(xiàn)腎功能損害，尿蛋白異常，見(jiàn)表1。

表1 兩組兔子血生化及尿蛋白測(cè)定結(jié)果

DM: diabetes mellitus; hs-CRP: high-sensitivity C-reactive protein; BUN: blood urea nitrogen; SCr: serum creatinine; UMA: urine microalbumin.*P<0.05vscontrol group (12 weeks);#P<0.05vsDM group (2 weeks).

3腎臟形態(tài)學(xué)改變

成模后12周空白組腎臟均未見(jiàn)病理改變；DM組腎小球毛細(xì)血管袢呈分葉狀，基底膜及系膜基質(zhì)增生；腎小管部分基底膜增厚，上皮細(xì)胞腫脹、顆粒變性，見(jiàn)圖1。10只成模新西蘭兔腎組織均有病理改變，糖尿病腎病成模率為83.3% (10/12)。

討 論

目前DN建模方式[4]有：(1)化學(xué)藥物誘導(dǎo)的糖尿病腎病模型：STZ用于SD大鼠[5-7]，或聯(lián)合高脂高糖飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗[8]，造模周期4～24周,期間模型的保持較難，動(dòng)物容易死于血糖波動(dòng)及感染。亦可單側(cè)腎臟切除后加重對(duì)側(cè)腎臟負(fù)擔(dān)，多因素綜合作用加速糖尿病腎病形成，但動(dòng)物在術(shù)后死亡率較高,且術(shù)后使用到抗生素等藥物,可能對(duì)腎臟有額外影響。(2)自發(fā)性糖尿病腎病模型：NOD(non-obesity diabetes)小鼠和LETL大鼠均可作為1型DM的動(dòng)物模型使用。2型DM自發(fā)性動(dòng)物模型有db/db小鼠、KKAy小鼠、OLETF大鼠、Zucker鼠[9]，db/db小鼠[10-11]，此類動(dòng)物種類有限，飼養(yǎng)條件要求高，發(fā)病率低，病程長(zhǎng)，價(jià)格昂貴，但在一定程度上減少了人為因素，更接近自然的人類疾病。(3)基因工程糖尿病腎病模型：Smad3敲除小鼠[12]、eNOS敲除鼠，轉(zhuǎn)基因RAGE小鼠、轉(zhuǎn)基因OVE26小鼠等，制備該動(dòng)物模型對(duì)技術(shù)要求高、價(jià)格昂貴等，限制了該類模型的應(yīng)用，但用基因工程方法建立動(dòng)物模型仍然是未來(lái)各種動(dòng)物模型研究的方向。

Figure 1. Photomicrographs of renal tissues of New Zealand rabbits in the two groups (HE staing).The arrow indicates the dilation of renal tube.

圖1兩組兔腎臟病理HE染色結(jié)果

鼠類抗病性較差，不利于反復(fù)采血、灌胃及靜脈注射等干預(yù)手段，體積小不利于影像學(xué)檢查如臟器超聲檢查、血管介入檢查及干預(yù)等，部分模型造價(jià)極高，故如何科學(xué)簡(jiǎn)便地制備糖尿病腎病動(dòng)物模型就顯得越發(fā)重要。兔DN模型的建立方法值得探討。朱昆等[13]曾使用ALX 100 mg/kg誘發(fā)兔糖尿病模型并聯(lián)系胰島素管理8周建立糖尿病腎病模型，其低血糖率為20%，死亡率為10%，血糖升高率為83.3%，糖尿病成模后的死亡率為10%，糖尿病腎病成模率為63.3%。本文參考文獻(xiàn)報(bào)道,在此基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn),先喂以高糖高脂飲食,誘發(fā)出胰島素抵抗,再繼以適量ALX注射,從而產(chǎn)生高血糖、形成腎臟病變。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物低血糖死亡率為8.3%,血糖升高率為100%，糖尿病成模后的死亡率為9%，糖尿病腎病成模率為66.7%。本實(shí)驗(yàn)改進(jìn)點(diǎn)為：(1)注射ALX后24～48 h給予葡萄糖飲用，嚴(yán)重低血糖者需要靜脈注射50%葡萄糖液，避免低血糖引起死亡。(2)只在注射ALX后1周內(nèi)使用胰島素管理。過(guò)多地使用胰島素對(duì)高血糖水平保持不利，血糖維持不到12周即下降。(3)糖尿病模型成立后根據(jù)個(gè)體血糖水平給予5%～10%葡萄糖水自由飲用，維持高糖高脂飲食，有利于高血糖的保持。(4)ALX分2次(ALX 50 mg/kg及隔日ALX 100 mg/kg)注射可以增加動(dòng)物的適應(yīng)性，保證血糖升高率。

盡管本實(shí)驗(yàn)所建立的模型極力模仿2型糖尿病患者的病程及臨床特征,但作為一種尚處于實(shí)驗(yàn)研究階段的新的動(dòng)物模型,該模型腎臟形態(tài)學(xué)變化與人類2型DN對(duì)比未見(jiàn)典型腎小球結(jié)節(jié)，系膜基質(zhì)增加及外周毛細(xì)血管滲出不明顯，有一定的差異?？傮w來(lái)說(shuō),該模型較好地模擬了2型糖尿病的發(fā)病過(guò)程,并出現(xiàn)了明顯糖尿病腎臟病變。作為一種較經(jīng)濟(jì)的2型DN模型,可用于DN發(fā)病機(jī)制及其藥物治療學(xué)方面的研究。

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ConstructionofaNewZealandrabbitmodelofdiabeticnephropathy

CHEN Xiao-ming, HUANG Dan-dan, LI Zhi-cheng

(DepartmentofCardiology,TheFirstAffiliatedHospitalofJinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:zichengli@163.net)

AIM: To establish a method to produce animal model of diabetic nephropathy (DN) in New Zealand rabbits using alloxan (ALX).METHODSTwenty male New Zealand rabbits were randomly divided into 2 groups: 8 rabbits in control group were fed with conventional feed such as buffer solution;12 in diabetes milleuts (DM) group were fed with high-sugar and high-fat diet (conventional feed plus 5% sucrose, 5% pork fat and 1% cholesterol) for 2 weeks, then intravenous injection of ALX at 50 mg/kg was given, and another dosage of 100 mg/kg ALX was intravenously injected after 48 h. The levels of blood glucose, blood cholesterol, triglyceride, urine microalbumin, and serum creatinine were detected before and 12 weeks after the processes of modeling. After 12 weeks, the rabbits were sacrificed，and the kidneys were taken for pathological examination.RESULTSThe successful model of DN in the rabbits had the characteristics of high blood glucose, abundant urine microalbumin (P<0.01), and corresponding morphological and functional changes of the kidneys.CONCLUSIONRabbits with high-sugar and high-fat diet plus twice intravenous injection of ALX at a total dose of 150 mg/kg (50 mg/kg and 100 mg/kg, respectively) shows low mortality and stable diabetes mellitus state. This method induces a typical DN model in 12 weeks.

New Zealand rabbits; Diabetic nephropathies; Alloxan; Models,animal

R332

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.04.035