麻風患者PBMC中TLR2 mRNA表達與IL-2含量的相關(guān)性研究

孫東生， 榮 蓉， 陳雷剛， 張慶波， 龔少智， 羅 麗， 王寶仁， 劉放鳴， 肖德欣， 賈長莎， 張信江

(1.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院 皮膚科, 貴州 遵義 563000；2貴陽市金陽醫(yī)院 皮膚科， 貴州 貴陽 550023；3.貴州畢節(jié)地區(qū)醫(yī)院 皮膚科， 貴州 畢節(jié) 551500；4. 貴州畢節(jié)地區(qū) CDC， 貴州 畢節(jié) 551500)

麻風患者PBMC中TLR2 mRNA表達與IL-2含量的相關(guān)性研究

孫東生1， 榮 蓉1， 陳雷剛1， 張慶波2， 龔少智1， 羅 麗1， 王寶仁3， 劉放鳴4， 肖德欣1， 賈長莎1， 張信江1

(1.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院 皮膚科, 貴州 遵義 563000；2貴陽市金陽醫(yī)院 皮膚科， 貴州 貴陽 550023；3.貴州畢節(jié)地區(qū)醫(yī)院 皮膚科， 貴州 畢節(jié) 551500；4. 貴州畢節(jié)地區(qū) CDC， 貴州 畢節(jié) 551500)

目的檢測麻風患者外周血單個核(PBMC)中TLR2m RNA的表達及血清中IL-2的水平,并與正常對照組比較，探討其在麻風發(fā)生和發(fā)展中的作用。方法應用SYBR Green熒光定量RT—PCR技術(shù)檢測TLR2mRNA在麻風現(xiàn)癥患者PBMC中的表達以及ELISA技術(shù)檢測IL-2在血清中的水平。結(jié)果麻風患者PBMC中，TLR2 mRNA表達水平0.56±0.06，對照組0.22±0.01；患者組明顯高于對照組(P<0.01)。IL-2 (pg/ml)23.42±16.45，對照組6.64±4.24；患者組明顯高于對照組(P<0.01)，且其兩者呈正相關(guān)(P=0.012,r=0.422)。結(jié)論麻風患者PBMC中TLR2mRNA的表達水平與血清IL-2水平有一定相關(guān)性，TLR2與IL-2可能參與了麻風的發(fā)生和發(fā)展過程并起到一定的作用。

麻風；Toll樣受體2； 白介素-2；外周血單一核細胞

Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)是一類重要的模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)在天然免疫中通過識別病原相關(guān)的分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)而發(fā)揮作用，主要包括對外來病原微生物的識別并誘導非特異的前炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生。麻風是由(mycobacterium leprae,ML)感染引起的一種慢性傳染性皮膚病。TLR2是識別麻風桿菌的主要受體，在對分枝桿菌的免疫反應中起著至關(guān)重要的作用[1]。TLR2介導的信號傳導產(chǎn)生IL-2等諸多多種細胞因子。我們通過測定麻風患者外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMC)中TLR2mRNA表達和血清IL-2水平，探討兩者的關(guān)系及在麻風免疫中的意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料與分組 隨機選擇貴州省畢節(jié)地區(qū)已確診登記的麻風現(xiàn)癥病人116例, 按馬德里分類法[2]，結(jié)核樣型(TT)34例，瘤型(LL)82例；正常對照組為當?shù)責o麻風及其他傳染病的健康成人50例，年齡、性別與麻風組類似。

1.2 實驗方法、試劑及儀器

1.2.1 無菌抽取患者與對照組靜脈血4 ml，置枸櫞酸鈉抗凝管混勻，用Histopaque-1077細胞分離液(美國Sigma公司)分離PBMC。采用RNAiso試劑(大連TaTkRa公司)一步法提取PBMC內(nèi)總RNA。所提取的總RNA用紫外分光光度計測A260、A280定量并檢測其純度，所有樣品比值均為1.8～2.0。取等量總RNA逆轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA，按試劑盒說明操作，逆轉(zhuǎn)錄反應條件：37℃15 min，85 ℃5 s。將cDNA溶液按100，101，102，103，104，105梯度稀釋(10倍梯度稀釋)后，制作標準曲線，代表各濃度的6個點基本在一條線上。

1.2.2 按RT—PCR擴增反應試劑盒說明操作，TLR2mRNA及β-actin引物序列。用Bio-熒光定量PCR儀檢測TLR2mRNA在PBMC中的表達。擴增反應條件：TLR2 PCR：預變性95 ℃10 s，1個循環(huán)；變性95 ℃5 s，退火6l ℃20 s，40個循環(huán)。β-actinPCR：預變性95 ℃10 s，1個循環(huán)；變性95 ℃5 s，退火60 ℃20 s，40個循環(huán)。PCR擴增曲線抬頭，結(jié)合融解曲線分析如出現(xiàn)解鏈峰則認為有擴增，并進行3%瓊脂糖凝膠電泳分析特異性。對有特異擴增的目的基因進行相對定量分析,目的基因的相對表達水平通過2-ΔΔct分析。

1.2.3 采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清IL-2。IL-2 ELISA試劑盒購自上海西唐生物技術(shù)有限公司。實驗操作參照試劑盒說明書進行，酶標儀(thermo,type1500)。

1.3 統(tǒng)計學方法 本研究數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學處理。采用秩和檢驗、pearson相關(guān)分析。P<0.05 為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 TLR2 mRNA在麻風患者PBMC中表達見表1.TLR2 mRNA在麻風患者PBMC中表達明顯高于對照組(P<0.01);麻風組IL-2的表達明顯高于對照組(P<0.01)，且其兩者呈正相關(guān)性(P=0.012,r=0.422)。

組 別例數(shù)TLR2mRNAIL-2(pg/ml)麻風組1160.56±0.0623.42±16.45對照組500.22±0.016.64±4.24

2.2 TLR2 mRNA在TT和LL中的表達。

TLR2 mRNA和IL-2在TT組與LL組中的表達未見顯著差異P>0.05)。 (見表2)。

組 別例數(shù)TLR2mRNAIL-2(pg/ml)LL820.62±0.0722.55±16.35TT340.43±0.1125.53±16.76

3 討論

TLR2是識別分枝桿菌的主要受體，其介導識別革蘭陽性菌細胞壁成分如肽聚糖、磷壁酸以及分支桿菌等[4，5]，TLR2通過識別分枝桿菌胞壁的組分,啟動信號傳導途徑,激活固有免疫細胞,導向抗分枝桿菌適應性免疫[7-12]。我們在研究中發(fā)現(xiàn)，TLR2 mRNA在麻風患者PBMC中表達明顯高于對照組(P<0.01)。這與羅麗[6]等人的研究結(jié)果一致。

TLR2介導的信號傳導產(chǎn)生多種細胞因子，包括TNF-α、IL-2、IL-12等。IL-2為Th1細胞分泌的細胞因子，主要介導細胞免疫。其在機體的免疫應答及調(diào)節(jié)中起著重要的作用，在許多慢性感染性疾病中同樣發(fā)揮著重要作用。Kang[13]等在研究TLR2時發(fā)現(xiàn)帶有突變的 TLR2 的麻風患者PBMC分泌IL-2等細胞因子的能力下降。也有研究[14]發(fā)現(xiàn)發(fā)生1型麻風反應的患者與沒有發(fā)生1型麻風反應的患者相比其IL-2水平無統(tǒng)計學意義。我們在研究中發(fā)現(xiàn)，麻風患者血清中IL-2的水平明顯高于對照組(P>0.01)。并且麻風患者PBMC中 TLR2 mRNA和IL-2的表達呈正相關(guān)性(P= 0.012,r=0.422)。這提示在麻風桿菌作用下通過TLR2的介導IL-2參與了麻風的發(fā)病過程，并在其中發(fā)揮了一定的作用。我們的研究同時發(fā)現(xiàn)，TLR2 mRNA在TT中的表達低于LL，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。IL-2在TT中的含量高于LL,但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；TLR2 mRNA在TT中的表達和血清中IL-2的含量無明顯相關(guān)性,這可能與研究標本量不多有關(guān)。

麻風的發(fā)病機制十分復雜，通過對TLR2 mRNA和IL-2相關(guān)性的分析,有助于我們對麻風發(fā)病機制的認識，為麻風的有效預防和控制提供一些理論依據(jù)。

[1] Campos M A, Almeida IC, Takeuchi O, et al. Activation of Toll-like receptor-2 by glycosylphosphatidylinositol anchors from a protozoan parasite[J].Immunol，2001,167:416-423.

[2]趙辨.臨床皮膚病學[M].南京：江蘇科學技術(shù)出版社.2001.358-373.

[3]Akira S, Takeda K. Functions of toll-like receptors:lessons from KO mice.CRBiol[J].2004,327(6):581-585.

[4]沈小雁,鄭捷.Toll 樣受體與細胞免疫[J]. 國外醫(yī)學皮膚性病學分冊,2003,299(2):106-109.

[5]Underhill D M, Ozinsky A,Smith KD, et al. Toll-like receptor-2 mediates mycobacteria-induced proinflammatory signaling in macrophages[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1999,96 (25):14459-14463.

[6]羅麗，劉源，張信江，等.Toll樣受體2、4在麻風患者外周血單一核細胞中的表達[J].中華皮膚科雜志，2010,43(9)：623-625.

[7]Means T K, Wang S,Lien E,et al.Human toll-like receptors mediate cellular activation by Mycobacterium tuberculosis [J].J Immunol,1999,63(7):3920-3927.

[8]Thoma-Uszynski S, Stenger S,Takeuchi O, et al .Induction of direct antimicrobial activity through mammalian toll-like receptors[J].Science,2001,291:1544-1547.

[9]Stenger S, Modlin RL. Control of Mycobacterium tuberculosis through mammalian Toll-like receptors[J].Curr Opin Immunol,2002,14(4):452-457.

[10]Tsuji S,Matsumoto M,Takeuchi O, et al.Maturation of human dendritic cells by cell wall skeleton of Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin:involvement of toll-like receptors[J].Infect Immun, 2000,68(12):6883-6890.

[11]Fulton S A, Reba S M,Pai RK,et al.Inhibition of major histocompatibility complex Ⅱexpression and antigen processing in murine alveolar macrophages by Mycobacterium bovis BCG and the 19-kilodalton mycobacterial lipoprotein[J].Infect Immun,2004,72(4):2101-2110.

[12]Thoma-Uszynski S, Kiertscher SM,Ochoa MT,et al.Activation of toll-like receptor 2 on human dendritic cells triggers induction of IL-12,but not IL-10[J].J Immunol,2000,165:3804-3810.

[13]Kang TJ,Lee S B,Chae GT.A polymorphism in the toll-like receptor 2 is associated with IL-12 production from monocyte in lepromatous leprosy[J].Cytokine,2002,20:56-62.

[14]Mariane M Stefani．Potential plasma markers of type 1 and type 2 leprosy reactions: a preliminary report[J].BMC Infectious Diseases,2009,9:75.

CorrelativestudyonexpressionofTLR2mRNAandserumlevelsofIL-2inperipheralbloodmononuclearcellsofpetientswithLeprosy

Sundongsheng，Rongrong，Chenleigang，Zhangqingbo,Gongshaozhi,Luoli,Wangbaoren，Liufangming，Xiaodexin，Jiachangsha，Zhangxinjiang

(1.Department of Dermatology, The Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Guizhou.Zunyi 563000,China ; 2. Department of Dermatology, Jinyang Hospital of Guiyang, Guizhou.Guiyang 550023, China; 3. Department of Dermatology, Regional Hospital of Bijie, Guizhou Bijie 551500, China; 4. Centers for Disease Control, Guizhou Bijie 551500, China)

ObjectiveTo research the expression levels of (toll-like recptor，TLR) 2 mRNA and the (interleukin-2，IL-2)in peripheral blood mononuclear cells(PBMC) of the patients with leprosy and the role in the occurrence and development of the leprosy.MethodsSYBR Green fluorescence quantitative RT-PCR was conducted to detect the expressions levels of TLR2mRNA and enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA)was conducted to detect levels of IL-2 in serum.ResultsThe levels of TLR2mRNA in the 116 cases of patients with leprosy were 0.56±0.06, that were 0.22±0.01 in the controls, the level of TLR2 mRNA in the patients with leprosy was significantly higher than the controls (P<0.01)。The levels(pg/ml) of IL-2 of the patients with leprosy were 23.42±16.45, that were 6.64±4.24 in the controls, The levels(pg/ml) of IL-2 of the patients with leprosy was significantly higher than the controls (P<0.01)。Positive correlation were found between levels of IL-2 and the levels of TLR2 mRNA in patients with leprosy(P= 0.012,r = 0.422).ConclusionThe levels of TLR2 mRNA and the levels of IL-2 were high and positive correlation. They may take part in the process of occurrence and development of the leprosy immune。

leprosy; TLR2; IL-2; PBMC

R755

A

1000-2715(2012)01-0034-03

國家自然科學基金(NO:30960350)；貴州省省長資金(NO:2006，48)。

張信江，男，研究方向：感染性皮膚病；E-mail:xinjiangzhang@sohu.com。

[收稿2011-10-09；修回2011-11-21]

(編輯：譚秀榮)