冠心病血瘀證的血清差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究＊

周倩倩 李治國 黃 力

冠心病屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹”、“心痛”范疇，血瘀證是冠心病中醫(yī)證候辨證中較常見的癥候類型。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在中醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用，為中醫(yī)證型實質(zhì)的研究提供了新的方法。本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)的相關(guān)技術(shù)方法，分析冠心病血瘀證患者和健康人群之間血清蛋白質(zhì)的差異，以期發(fā)現(xiàn)與冠心病血瘀證相關(guān)的特異性蛋白質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 對象與分組

冠心病血瘀證患者（疾病組）均為2009年9月～2010年11月中日友好醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合心內(nèi)科門診及住院病人8例，男女各4例，平均年齡69.50±9.78歲；健康人群（對照組）8例，均來自北京中醫(yī)藥大學(xué)體檢正常的健康志愿者，男3例，女5例。病例組西醫(yī)診斷符合 WHO／ISEC制定的《缺血性心臟病的命名和診斷標準》［1］，中醫(yī)診斷標準符合中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會心血管病專業(yè)委員會于1990年修訂的《冠心病中醫(yī)辨證標準》［2］，并參考中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會活血化瘀專業(yè)委員會于1986年制定的血瘀證診斷標準［3］。對照組無糖尿病、高血壓、高脂血癥、腎臟疾病及外周血管病變；排除已發(fā)生心肌缺血而目前處于穩(wěn)定期的患者，包括經(jīng)冠狀動脈造影證實的冠狀動脈粥樣硬化性心臟病或陳舊心肌梗塞，或以前曾行經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（PCI）或冠狀動脈搭橋術(shù)后患者。

1.2 主要實驗試劑和儀器

固相 pH 梯度干膠條（pH3－10NL，24cm）、IPG buffer（pH3－10）、二硫蘇糖醇（DTT）、SDS、Tris均購自美國Amersham Bioscience公司；碘乙酰胺、考馬斯里亮藍G－250購自美國Amresco公司；四甲基乙二胺（TEMED）、過硫酸銨（AP）購自美國Sigma公司。

IPG phorTM等電聚焦儀（美國Amersham Pharmacia Biotech公司），Ettan DaltTwelve垂直電泳系統(tǒng)（美國Parafilm公司），ImageScannerⅢ透射掃描儀、Labscan掃描控制和分析前處理軟件（美國GE Healthcare公司），PD－Quest圖像分析軟件（美國Bio－Rad公司），MALDI－TOF－MS質(zhì)譜儀（美國UltraFlexⅢTOF＆TOF／TOF，Bruker Daltonics公司）。

1.3 血清標本的采集和電泳

清晨采集兩組人群外周靜脈血3ml于非抗凝真空采血管中，3 000rpm離心10min，分離血清，于－80℃冰箱內(nèi)貯存?zhèn)溆?。采用Bradford法測定各血清樣本的蛋白濃度后進行雙向凝膠電泳。第一向固相PH梯度等點聚焦（IEF）：于含1mg蛋白的血清樣本中加入1%IPGbuffer，水合液稀釋至450μl，混勻上樣，水化合等點聚焦在20℃進行，總電壓為90 000Vh。 具 體 參 數(shù) 如 下：30V12h，250V1h，500V1h，1 000V1h，8 000V30min，8 000V 至90 000 Vh。第二向垂直SDS－PAGE電泳：平衡后的IPG膠條移至12%SDS－PAGE膠上端，加入SDS電泳緩沖液，電泳條件為25℃，2W／gel電泳30min，然后按每塊膠17W的恒功率電泳，直到溴酚藍指示線到達凝膠底邊為止。2－DE凝膠固定后以考馬斯亮藍G－250染色。

1.4 圖像分析和質(zhì)譜鑒定

凝膠脫色后經(jīng)LabScan和ImageScanner透射掃描，運用PD－Quest軟件對各組凝膠圖譜進行蛋白點檢測、標準化、匹配、統(tǒng)計學(xué)處理，找尋差異表達的蛋白質(zhì)點。采用 MALDI－TOF－MS進行質(zhì)譜分析，獲得肽質(zhì)量指紋譜（由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)中心完成），運用 Mascot軟件搜索Swissprot和NCBInr數(shù)據(jù)庫，得到差異蛋白質(zhì)的相關(guān)信息。

2 結(jié) 果

2.1 兩組2－DE結(jié)果

對兩組中單個血清樣本分別進行雙向凝膠電泳分離，分兩次進行，第一次3例／組，第二次5例／組，兩組各獲得8個凝膠圖譜，所得典型的雙向凝膠電泳圖如圖1所示。圖譜信息經(jīng)PD－Quest軟件分析顯示，對照組及病例組的平均蛋白質(zhì)點數(shù)分別為153.60±27.57和146.60±19.99，通過背景消減、匹配分析，共得到12個差異蛋白質(zhì)點，其中，部分差異蛋白質(zhì)點的局部放大圖見圖2。

圖1 典型雙向凝膠電泳圖示例

圖2 差異點局部放大圖示例

2.2 質(zhì)譜鑒定結(jié)果

對12個蛋白質(zhì)點進行質(zhì)譜分析，得到各個點的肽質(zhì)量指紋譜，如圖3所示。運用Mascot軟件搜索Swissprot和NCBInr數(shù)據(jù)庫，共有11個點得到陽性鑒定，通過整合重復(fù)蛋白點后，確認為6個差異蛋白質(zhì)點，其中，病例組與對照組相比，表達上調(diào)的點有3個：視黃醇結(jié)合蛋白4（Retinol－Binding Protein 4）、結(jié)合珠蛋白（Haptoglobin）、血清白蛋白（Serum Albumin），表達下調(diào)的點有1個：載脂蛋白 A1（Apolipoprotein A－I），在兩次實驗中表達不一致的點有2個，為避免實驗的假陽性，這2個點暫不予以考慮，如表1所示。

表1 6個差異蛋白質(zhì)點

圖3 蛋白質(zhì)點的MALDI－TOF－MS質(zhì)譜結(jié)果示例

3 討 論

視黃醇結(jié)合蛋白4與心血管疾病的關(guān)系在國外研究中已有報道［4，5］，認為其血清水平的升高可能與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［6，7］，有研究發(fā)現(xiàn)冠心病患者的血清水平明顯高于健康者［8］；國內(nèi)也有研究得出類似結(jié)果［9］。

結(jié)合珠蛋白是一種急性相蛋白［10］，在多種應(yīng)激反應(yīng)過程中，其血清表達明顯升高；在抗氧化反應(yīng)、減少細胞損傷、炎癥反應(yīng)中，結(jié)合珠蛋白也發(fā)揮重要作用［11］。

血清白蛋白是人體血清中含量最豐富的蛋白質(zhì)，研究認為其濃度水平對冠心病的早期發(fā)現(xiàn)及預(yù)后具有一定的預(yù)測價值［12］。國外一項薈萃分析表明，低血清白蛋白組發(fā)生冠心病及冠心病的死亡風(fēng)險均明顯高于高血清白蛋白組［13］，同時國內(nèi)研究［14］發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，血清白蛋白水平在急性心肌梗死患者組明顯降低，且與其臨床預(yù)后有很好的相關(guān)性。

載脂蛋白A1是高密度脂蛋白（HDL）的主要蛋白成分，能夠促進膽固醇的清除，并且在抗炎癥反應(yīng)、抗氧化反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用［15］，目前研究［16］表明，ApoA1能防止動脈粥樣硬化發(fā)生，對評價心血管疾病的危險程度、心肌梗死及其它心血管事件具有很好的預(yù)測價值。

既往對冠心病血瘀證的客觀化研究［17］發(fā)現(xiàn)，冠心病血瘀證與血液流變學(xué)、微循環(huán)障礙、血脂代謝障礙、血小板功能及抗凝－纖溶系統(tǒng)異常、血管內(nèi)皮細胞損傷及免疫功能異常等過程相關(guān)。國內(nèi)有研究在利用雙向電泳技術(shù)尋找與心絞痛血瘀證相關(guān)的蛋白時，發(fā)現(xiàn)了包括載脂蛋白A1、結(jié)合珠蛋白、血清白蛋白等在內(nèi)的與血瘀證相關(guān)的差異蛋白質(zhì)［18］，認為不穩(wěn)定心絞痛血瘀證可能是一種炎癥反應(yīng)，同時與脂代謝紊亂、凝血因子異常、心肌損傷等有關(guān)［19］。而在另一冠心病血瘀證的血漿蛋白質(zhì)組學(xué)研究中［20］，發(fā)現(xiàn)了纖維蛋白原、免疫球蛋白、粒酶等與凝血、內(nèi)皮損傷、免疫炎癥反應(yīng)等相關(guān)的蛋白質(zhì)，可以發(fā)展成為冠心病血瘀證的診斷標記物。

本文的研究結(jié)果表明，冠心病血瘀證相關(guān)的蛋白質(zhì)主要集中于炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)代謝方面，與文獻報道基本一致，同時也發(fā)現(xiàn)了像視黃醇結(jié)合蛋白4等具有深入研究意義的蛋白質(zhì)，為進一步尋找冠心病血瘀證相關(guān)蛋白提供了線索。由于雙向凝膠電泳技術(shù)存在自身不足和局限性，本研究只得到了與冠心病血瘀證相關(guān)的部分蛋白質(zhì)的信息，隨著技術(shù)的不斷創(chuàng)新和發(fā)展，實驗結(jié)果及其意義會得到進一步驗證和完善，其機制有待進一步探索。

1 陳灝珠.實用內(nèi)科學(xué)［M］.第12版.北京：人民衛(wèi)生出版社.2005：1 472～1 473.

2 中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會心血管病專業(yè)委員會.冠心病中醫(yī)辨證標準［J］.中西醫(yī)結(jié)合雜志，1991，11（5）：257～258.

3 中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會活血化瘀專業(yè)委員會.血瘀證診斷標準［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，1987，7（3）：129～131.

4 Ingelsson E，Sundstr?m J，Melhus H，et al.Circulating retinolbinding protein 4，cardiovascular risk factors and prevalent cardiovascular disease in elderly cardiovascular disease in elderly［J］.Atherosclerosis，2009，206（1）：239～244.

5 Sasaki M，Otani T，Kawakami M，et al.Elevation of plasma retinol－binding protein 4and reduction of plasma adiponectin in subjects with cerebral infarction［J］.Metablism ：Clinical and Experimental，2010，59（4）：527～532.

6 Thomas BO，Jens RA，F(xiàn)ranziska S，et al.Relation between retinol，retinol－binding protein 4，transthyretin and carotid intima media thickness［J］.Atherosclerosis，2010，213（2）：549～51.

7 Erik IN，Lars L.Circulating retinol－binding protein 4and subclinical cardiovascular disease in the elderly［J］.Diabetes care，2009，32（4）：733～735.

8 Hyun JK，Hyun SY，P KK，et al.Comparative analysis of serum proteomes of patients with cardiovascular disease［J］.Clinical Biochemistry，2011，44（2～3）：178～184.

9 王湘蕓.視黃醇結(jié)合蛋白4與代謝綜合癥的相關(guān)性研究［D］.上海：第二軍醫(yī)大學(xué)，2010：15～28.

10 Henrik HP，Jens PN，et al.Application of acute phase protein measurements in veterinary clinical chemistry［J］.Veterinary Research，2004，35（2）：163～187.

11 Langlois MR，Delanghe JR.Biological and clinical significance of haptoglobin polymorphism in humans［J］.Clinical Chemistiy，1996，42（10）：1 589～1 600.

12 Schalk BM，Visser M，Bremmer MA，et al.Change of serum albumin and risk of cardiovascular disease and all－cause mortality［J］.American journal of epidemiology，2006，164（10）：969～977.

13 John D，Rory C，Paul A，et al.Association of fibtinogen，C－reactive protein，albumin，or leukocyte count with coronary heart disease［J］.JAMA，1998，279（18）：1 477～1 482.

14 鄧次妮，沈潞華.急性心肌梗死患者白蛋白水平的變化及其意義的臨床研究［J］.北京醫(yī)學(xué)，2006，28（6）：331～333.

15 肖育權(quán)，許麗嬌.60例冠心病患者血清載脂蛋白A1和B的檢測分析［J］.現(xiàn)代醫(yī)院，2009，9（3）：84～85.

16 Barter PJ，Rye KA.The rationale for using apoA－I as a clinical marker of cardiovascular risk［J］.Journal of Internal Medicine，2006，259（5）：447～454.

17 李 磊，劉建勛.冠心病血瘀證結(jié)合客觀化研究概況［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2008，14（15）：396～400.

18 趙慧輝，王 偉，李 宏.雙向電泳－質(zhì)譜技術(shù)篩選心絞痛血瘀證相關(guān)蛋白的研究［J］.北京中醫(yī)藥，2008，27（2）：96～99.

19 趙慧輝，楊 帆，王 偉，等.無標記定量法研究冠心病不穩(wěn)定心絞痛血瘀證的差異蛋白質(zhì)組［J］.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報，2010，31（2）：285～292.

20 吳紅金，馬增春，高 月，等.蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對冠心病血瘀證相關(guān)蛋白的研究［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2005，3（3）：189～191.