血管生成素1，2通過誘導型一氧化氮合酶調(diào)節(jié)失血性休克大鼠血管低反應性＊

徐 競 藍 丹 李 濤 楊光明 劉良明

休克后血管反應性呈早期增高和晚期降低的雙相變化［1］，其發(fā)生機制尚不清楚。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，血管生成素－1（Angiopoietin－1，Ang－1）、血管生成素－2（Angiopoietin－2，Ang－2）在失血性休克后大鼠腸系膜上動脈（Superior Mesenteric Artery，SMA）中呈時間上的差異表達，并通過Tie－2受體參與失血性休克血管反應性雙相變化的形成［2］，蛋白激酶B（PKB／Akt）、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38Mitogen－Activated Protein Kinase，p38MAPK）、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（Extracellular Signal Regulated Kinase，Erk）幾種分子參與了調(diào)節(jié)過程，但具體調(diào)節(jié)機制目前尚不清楚。

根據(jù)基礎研究，Ang－1和Ang－2激活血管內(nèi)皮細胞（Vascular Endothelial Cell，VEC）上的 Tie－2受體之后，可經(jīng)磷脂酰肌醇3－激酶（Phosphatidylinositol 3－Kinase，PI3K）激活Akt，還可經(jīng)過銜接蛋白Grb2活化p38MAPK和Erk，再通過激活誘導型一氧化氮合酶（Inducible Nitric Oxide Synthase，iNOS）產(chǎn)生一氧化氮（Nitric Oxide，NO）［3，4］，NO是目前已知的一種對血管舒縮反應性有重要調(diào)節(jié)作用的分子［5］。那么 Ang－1和 Ang－2能否通過 Akt、p38MAPK和Erk激活iNOS產(chǎn)生NO來調(diào)節(jié)失血性休克大鼠血管反應性的雙相變化即成為有重要意義的研究課題。本實驗采用離體微血管環(huán)張力測定技術和Western Blotting方法，觀察實驗大鼠失血性休克后不同時間點SMA中iNOS蛋白表達變化、iNOS抑制劑對Ang－1和Ang－2調(diào)節(jié)缺氧早期和晚期血管反應性的影響以及給予Ang－1和Ang－2、Tie－2、Akt、p38MAPK、Erk 等 的 抑 制 劑 后 缺 氧VEC和血管平滑肌細胞（Vascular Smooth Muscle Cell，VSMC）中iNOS蛋白表達和細胞培養(yǎng)上清中NO含量的變化，以探討iNOS在Ang－1和Ang－2調(diào)節(jié)休克血管反應性雙相變化中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細胞準備

采用第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院實驗動物中心清潔級SD大鼠，雌雄各半，體重200～230g，戊巴比妥鈉（0.1ml／100g體重）腹腔注射麻醉。

根據(jù)文獻［6］進行VEC和VSMC原代細胞培養(yǎng)，取第3代至第5代的VEC和VSMC細胞，按照細胞計數(shù)1∶1比例進行混合培養(yǎng)，次日進行實驗。

1.2 主要試劑

Ang－1、Ang－2、iNOS 抗 體、Akt抑 制 劑 VIII trifluoroacetate salt hydrate、Erk抑制劑PD98059、p38MAPK抑制劑SB203580均購自美國Sigma－Aldrich公司，Tie2阻斷抗體購自美國Santa Cruz公司，iNOS抑制劑L－NIL hydrochloride購自英國Tocris公司，NO檢測試劑盒購自德國Calbiochem公司。

1.3 實驗內(nèi)容

（1）取大鼠48只，麻醉后右側股動脈插管接血壓計［7］，隨機將其中8只作正常對照，其余40只分為休克10min、30min、1h、2h、4h組，每組8只，經(jīng)右側股動脈放血使平均動脈壓（Mean Artery Pressure，MAP）降至40mmHg，并維持不同時間，制作不同休克時間的失血性休克模型［7］。休克完成后將大鼠斷頭處死，取SMA組織測定iNOS的蛋白表達。

（2）另取大鼠104只，麻醉后將大鼠斷頭處死，分離SMA一級分支動脈血管，切割成長2.5mm的血管環(huán)（直徑10～100μm），隨機分為13組：正常對照組、缺氧10min組；Ang－1＋缺氧10min組、Ang－2＋缺氧10min組；iNOS抑制劑＋缺氧10min組、iNOS抑制劑＋Ang－1＋缺氧10min組、iNOS抑制劑＋Ang－2＋缺氧10min組；缺氧4h組、Ang－1＋缺氧4h組、Ang－2＋缺氧4h組；iNOS抑制劑＋缺氧4h組、iNOS抑制劑＋Ang－1＋缺氧4h組、iNOS抑制劑＋Ang－2＋缺氧4h組，每組8只血管環(huán)。實驗采用Ang－1、Ang－2濃度均為200ng／ml，iNOS抑制劑濃度為1×10－4mol／L。缺氧處理方法［6］：將血管浸入無糖 Krebs－Henseleit（K－H）液，置于缺氧罐中，充入缺氧氣體（5%CO2和95%N2）15min后夾閉導氣管10min，反復5次，最后一次充氣后，按各實驗組要求分別夾閉10min或4h完成缺氧。最后測定血管反應性。

（3）取培養(yǎng)的VEC和VSMC混合細胞32瓶，隨機分為8組：正常對照組、缺氧4h組、Ang－2＋缺氧4h組、Tie－2抑制劑＋缺氧4h組、Akt抑制劑＋缺氧4h組、p38MAPK抑制劑＋缺氧4h組、Erk抑制劑＋缺氧4h組、iNOS抑制劑＋缺氧4h組，每組4瓶。實驗當天將細胞培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基，Ang－1和 Ang－2濃度均為200ng／ml，Tie－2阻斷抗體1：100，Akt抑制劑1×10－5mol／L、p38MAPK 抑制劑1×10－5mol／L，Erk抑制劑1×10－5mol／L，iNOS抑制劑1×10－4mol／L。缺氧處理方法同（2），完畢后取細胞培養(yǎng)上清測定NO含量，收集細胞測定iNOS蛋白表達。

1.4 檢測方法

1.4.1 血管反應性測定：將SMA一級分支血管環(huán)固定于微血管肌動描記儀，浸入K－H液，采用累積濃度法檢測微血管環(huán)對梯度濃度去甲腎上腺素（NE）的反應性，作量－效曲線，曲線擬合法求NE的最大收縮力（Emax），以 NE的Emax評價血管反應性［8］。

1.4.2 iNOS蛋白表達：取SMA組織或細胞，提取總蛋白，常規(guī)Western Blotting方法檢測蛋白條帶，采用8%SDS－PAGE膠，iNOS抗體滴度1∶10 000，Quantity One軟件分析蛋白條帶，以iNOS／β－actin光密度比值反映iNOS蛋白表達。

1.4.3 NO含量測定：取VEC和VSMC的細胞培養(yǎng)上清，采用硝酸還原酶法測定NO含量，檢測步驟按照NO檢測試劑盒進行。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 失血性休克后不同時間iNOS的蛋白表達變化

iNOS在正常對照組表達很低（與β－actin的比值均數(shù)為0.0694），失血性休克30min后iNOS表達逐漸增高，休克30min、1h、2h和4h組均數(shù)分別增高至0.1469、0.1984、0.2595和0.2489 （P＜0.01）。見圖1。

圖1 失血性休克后iNOS的蛋白表達變化

2.2 iNOS抑制劑對Ang－1和Ang－2調(diào)節(jié)缺氧早期和晚期血管反應性的影響

iNOS抑制劑對離體SMA缺氧早期（10min）的血管高反應性及Ang－1、Ang－2對其的作用無顯著影響，但可恢復缺氧晚期（4h）的血管低反應性，NE的Emax均數(shù)由5.875mN增高至8.937mN （P＜0.01）；還可以抑制Ang－2進一步降低血管反應性的作用，NE的Emax均數(shù)由3.444mN增高至7.492mN（P＜0.01）。見圖2。

2.3 Ang－1和Ang－2調(diào)節(jié)缺氧晚期血管低反應性時iNOS蛋白表達和NO含量變化

培養(yǎng)VEC和VSMC混合細胞缺氧4h組的iNOS蛋白表達較正常對照組顯著增高（P＜0.01），Ang－1、Tie－2抑制 劑、p38MAPK 抑 制劑 和 Erk 抑制劑可顯著抑制其增高，使其光密度比值均數(shù)由缺氧4h的0.2841分別降低至0.0790、0.0924、0.0793和0.0899（P＜0.01）；Akt抑制劑對其無顯著影響。見圖3。

圖2 iNOS抑制劑對Ang－1和Ang－2調(diào)節(jié)缺氧早期和晚期血管反應性的影響

圖3 Ang－1和Ang－2調(diào)節(jié)缺氧晚期血管反應性時iNOS蛋白表達變化

混合VEC和VSMC培養(yǎng)上清液中NO含量在缺氧4h組較正常對照組顯著增高，（30.5941vs 0.8923 μmol／108細胞，P＜0.01），Ang－1，Tie－2、Akt、p38MAPK、Erk、iNOS抑制劑均可抑制其增高，使其分別降低至15.2079、9.3667、20.0924、14.9076、13.9129和13.0048μmol／108細胞 （P＜0.05或P＜0.01）。見圖4。

圖4 Ang－1和Ang－2調(diào)節(jié)缺氧晚期血管反應性時NO含量變化

3 討 論

研究顯示，Ang－1和Ang－2激活VEC上的Tie－2受體之后，可經(jīng)Akt、p38MAPK和Erk調(diào)節(jié)iNOS活性和 NO 產(chǎn)生［3，4］；還有報道，在脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）誘導內(nèi)毒素休克的人臍靜脈內(nèi)皮細胞，LPS通過磷酸化和活化 Akt、p38MAPK及Erk，激活iNOS，產(chǎn)生NO，調(diào)節(jié)內(nèi)毒素休 克 的 血 管 反 應 性［9，10］。 因 此 推 測 Ang－1 和Ang－2可能通過Akt、p38MAPK和Erk激活iNOS產(chǎn)生NO，從而調(diào)節(jié)失血性休克血管反應性的雙相變化。

本實驗結果發(fā)現(xiàn)，iNOS抑制劑可明顯恢復缺氧4h的血管低反應性，以及顯著抑制Ang－2，進一步降低缺氧4h血管反應性的作用，提示iNOS參與了Ang－1和Ang－2對失血性休克晚期血管低反應性的調(diào)節(jié)；失血性休克后SMA中的iNOS蛋白表達逐漸增高，Ang－1、Tie－2、p38MAPK 和 Erk抑制劑可顯著降低缺氧4h的VEC和VSMC混合細胞中iNOS蛋白表達和NO含量增高，提示失血性休克晚期，Ang－1和Ang－2通過p38MAPK和Erk調(diào)節(jié)iNOS的蛋白表達和NO大量產(chǎn)生，以調(diào)節(jié)血管低反應性。

大量文獻表明，NO對機體的作用非常復雜，有報道其介導了PI3K－Akt－內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）途徑對小腸缺血的保護作用［11］，但也有報道其介導了LPS誘導的血管內(nèi)皮細胞損傷［10］。本實驗結果提示，iNOS和NO在失血性休克晚期起到了降低血管收縮功能的損傷性作用。對于NO具有復雜作用的原因，有研究認為，NO如同一把“雙刃劍”，其作用究竟是保護還是損傷主要取決于誘導NO產(chǎn)生的酶和NO產(chǎn)生的量，iNOS、eNOS和神經(jīng)型一氧化氮合酶（nNOS）誘導產(chǎn)生的NO量之比為105∶16∶96；就心臟而言，0.1～10μmol的NO即可增強收縮，加快心率，而＞100μmol的NO則表現(xiàn)為負性收縮和負性頻率的作用［12］。因此本實驗中NO對血管反應性的損傷可能由于iNOS誘導NO大量產(chǎn)生所引起。但NO導致休克血管反應性損傷的具體機制尚待進一步研究。

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